Fungicida

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 8431 (2023) Citar este artículo

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El género de hongos Alternaria es un patógeno global de más de 100 cultivos y está asociado con la mancha foliar por Alternaria en manzanas (Malus x domestica Borkh.), que se está expandiendo a nivel mundial y provoca necrosis foliar grave, defoliación prematura y grandes pérdidas económicas. A la fecha, la epidemiología de muchas especies de Alternaria aún no está resuelta, ya que pueden ser saprofitas, parásitas o cambiar entre ambos estilos de vida y también están clasificadas como patógenos primarios capaces de infectar tejido sano. Sostenemos que Alternaria spp. no actúa como patógeno primario, sino sólo como oportunista dependiente de necrosis. Estudiamos la biología de la infección de Alternaria spp. bajo condiciones controladas y monitoreamos la prevalencia de enfermedades en huertos reales y validamos nuestras ideas aplicando tratamientos sin fungicidas en experimentos de campo de 3 años. Alternaria spp. Los aislados no fueron capaces de inducir necrosis en tejido sano, sino sólo cuando existían daños inducidos previamente. A continuación, los fertilizantes aplicados foliares, sin efecto fungicida, redujeron los síntomas asociados a Alternaria (− 72,7%, SE: ± 2,5%) con la misma eficacia que los fungicidas. Finalmente, las concentraciones bajas de magnesio, azufre y manganeso en las hojas se relacionaron consistentemente con la mancha foliar asociada a Alternaria. La incidencia de las manchas en los frutos se correlacionó positivamente con la mancha foliar, también se redujo con los tratamientos con fertilizantes y no aumentó durante el almacenamiento a diferencia de otras enfermedades mediadas por hongos. Nuestros hallazgos sugieren que Alternaria spp. puede ser una consecuencia de la mancha foliar más que su causa principal, ya que parece colonizar la mancha foliar fisiológicamente inducida. Teniendo en cuenta las observaciones existentes de que la infección por Alternaria está relacionada con huéspedes debilitados, la distinción puede parecer leve, pero es de gran importancia, ya que ahora podemos (a) explicar el mecanismo por el cual diferentes tensiones resultan en la colonización con Alternaria spp. y (b) sustituir un fertilizante foliar básico por fungicidas. Por lo tanto, nuestros hallazgos pueden resultar en reducciones significativas en los costos ambientales debido al uso reducido de fungicidas, especialmente si el mismo mecanismo se aplica a otros cultivos.

El género panglobal Alternaria comprende hongos saprotróficos que pueden volverse patógenos para diversos cultivos, especialmente cuando las plantas hospedantes están debilitadas y sometidas a estrés1,2,3. Hay más de 100 especies de plantas hospedantes, incluidos cultivos importantes como la patata, el tomate, el trigo, el repollo, el girasol, el algodón, la soja y la manzana, en los que los hongos suelen provocar lesiones necróticas4,5,6,7,8. Debido a su amplia gama de huéspedes, Alternaria se encuentra entre los patógenos más dañinos del mundo. En el manzano (Malus x domestica Borkh), los síntomas asociados a Alternaria incluyen mancha foliar y manchas posteriores en el fruto, y pueden provocar una defoliación del 85 % y hasta un 80 % de frutos infestados por huerto (Figura 1 complementaria), lo que provoca grandes pérdidas económicas1,7 ,9,10,11. En Asia se cree que es la enfermedad económicamente más importante para la producción de manzanas12,13. A nivel mundial, la producción de manzanas está dominada por unas pocas variedades: 'Golden Delicious', 'Red Delicious', 'Fuji' y 'Gala'. Estas cuatro variedades principales representan el 60,3% de la producción mundial (si se excluye a China, cuya calidad de los datos es menos segura, es el 50,8%, datos de 2015), todas las cuales son susceptibles a la mancha foliar por Alternaria, lo que exacerba el impacto de la enfermedad14. 15,16. Además, es importante mencionar que Alternaria spp. puede causar otras enfermedades en las manzanas, como la enfermedad del núcleo mohoso, que afecta la calidad interna de la fruta y resulta en pérdidas financieras significativas para los productores y cultivadores de manzanas durante el almacenamiento poscosecha10,17,18.

Desde el primer informe sobre la mancha foliar por Alternaria en manzanas en 1926 (EE.UU.), la enfermedad se ha extendido a las regiones productoras de manzanas de todo el mundo (Asia, Rusia, Australia), primero en regiones con clima árido y cálido, incluido el sur de Europa19, y recientemente también regiones templadas (por ejemplo, Países Bajos, 2018)9,11,14,19,20,21,22,23. Las condiciones cálidas y los períodos de calor son necesarios para el desarrollo de la mancha foliar por Alternaria y los primeros síntomas suelen aparecer a principios del verano (Figuras complementarias 1a y 2). Las lluvias posteriores y las caídas de temperatura a fines del verano aumentan drásticamente los síntomas (Figura complementaria 1b), lo que provoca una defoliación severa (Figura complementaria 1c) y manchas en los frutos (Figura complementaria 1d)12. A pesar de su importancia, la epidemiología de Alternaria en la manzana aún no se conoce bien. En consecuencia, la estrategia de protección vegetal para controlar la enfermedad de Alternaria no es específica y, a menudo, no es eficaz. Los agricultores aplican regularmente fungicidas mediante fumigaciones rutinarias con hasta ocho tratamientos por temporada de crecimiento como estrategia de seguro de cosecha17,24. Sin embargo, la política agrícola actual apunta a reducir drásticamente el uso de pesticidas (por ejemplo, hasta un 50% de reducción para 2030; Comisión Europea), particularmente porque los pesticidas sintéticos constituyen una de las amenazas más importantes para los organismos no objetivo y para la contaminación del suelo y agua25,26,27,28,29,30. Por lo tanto, actualmente existe una gran demanda de enfoques alternativos en protección vegetal para salvaguardar la seguridad alimentaria.

Es importante destacar que los síntomas de la mancha foliar por Alternaria son muy similares a una enfermedad fisiológica poco conocida del manzano que se describió como "mancha foliar fisiológica (o necrótica)"13,17,31. Ambas enfermedades se caracterizan por manchas foliares necróticas similares, la misma progresión de la enfermedad y condiciones climáticas similares que favorecen el brote de la enfermedad (ver también la "Discusión" complementaria: Dos enfermedades, mismos síntomas, Fig. 1a,b). Se cree que la mancha foliar fisiológica es causada por desequilibrios de nutrientes en las hojas, provocados por caídas de temperatura después de los períodos de calor en verano13,31. Los primeros estudios demostraron que los fungicidas orgánicos que contienen zinc y manganeso (ditiocarbamatos), así como los tratamientos con fertilizantes foliares de magnesio y manganeso, podrían reducir la mancha foliar fisiológica32. Por el contrario, los fertilizantes potásicos, un antagonista de la absorción de magnesio, aumentaron la defoliación33. Sin embargo, estas investigaciones previas no resolvieron si y qué tipo de desequilibrio de nutrientes era responsable de la enfermedad y no desarrollaron una cura efectiva31,34. Además, los fungicidas con diferentes modos de acción (código FRAC: 3 y P 09) también redujeron la mancha foliar fisiológica, pero no se identificó un patógeno35,36.

Modelo conceptual que describe la hipótesis existente sobre la formación de manchas en hojas y frutos (Alternaria) en manzanas y nuestra nueva hipótesis, una síntesis, el complejo de Alternaria. Existen dos hipótesis para el desarrollo de los mismos síntomas: (A) la hipótesis del patógeno de la mancha foliar por Alternaria (biótica) y (B) la hipótesis de la mancha foliar fisiológica (abiótica). Proponemos una síntesis de ambos (C) el complejo de Alternaria. Los factores ambientales provocan desequilibrios de nutrientes con formación de manchas foliares (Ci), que posteriormente pueden ser colonizadas por Alternaria spp. (C-ii). Otros factores, como la fitotoxicidad de los agentes activos y los ácaros rojos, también pueden formar las condiciones necesarias para que Alternaria spp. colonización (C-iii). Un desencadenante desconocido puede cambiar la forma de vida saprofita a una forma de vida patógena (producción de toxinas) de Alternaria spp., con el consiguiente aumento de los síntomas típicos. Lo mismo ocurre con la formación de manchas en los frutos (D). Las lenticelas predañadas son la condición previa obligatoria para la colonización por Alternaria spp., con la consiguiente aparición de síntomas.

En resumen, las causas de la mancha foliar por Alternaria, la mancha foliar fisiológica y las manchas en los frutos no se conocen bien. Además, las hipótesis hasta la fecha están en conflicto con la evidencia existente: si la mancha foliar fuera causada puramente por Alternaria spp. infección, entonces no debería verse afectada por los fertilizantes aplicados en las hojas, ya que no tienen actividad fungicida. De manera similar, si los desequilibrios de nutrientes fueran la única causa, ¿por qué los fungicidas con diferentes modos de acción reducen la gravedad de la mancha foliar? Dada la similitud en los síntomas, proponemos una nueva síntesis. Nuestra hipótesis es que la mancha foliar fisiológica y la mancha foliar por Alternaria son dos enfermedades interrelacionadas: el complejo de Alternaria. La necrosis foliar inicial, causada por desequilibrios de nutrientes en los manzanos (como se muestra en la Fig. 1c), es un requisito previo necesario para la posterior colonización por Alternaria spp., que a su vez puede exacerbar la gravedad de la enfermedad.

Predecimos (1) que existen distintas firmas de nutrientes foliares asociadas con la enfermedad, (2) que Alternaria spp. no puede infectar tejidos sanos de manzana sin necrosis preexistente, y (3) que las enfermedades asociadas a Alternaria pueden controlarse previniendo la necrosis foliar inicial mediante fertilizantes foliares.

Estudiamos el desarrollo de la enfermedad de la mancha foliar en huertos de manzanos en Tirol del Sur (Italia), donde la mancha foliar fue cada vez más prevalente desde 1999 en adelante. Para revelar qué nutrientes de las hojas podrían causar la mancha foliar inicial, vinculamos las concentraciones de nutrientes de las hojas (N, P, K, Ca, Mg, S, B, Fe, Mn, Cu y Zn) con la gravedad de la mancha foliar utilizando el análisis Random Forest ( para un análisis detallado, consulte los Resultados complementarios S1, Figuras complementarias 4 a 6, Tabla complementaria 5).

Los datos se obtuvieron de árboles maduros de las variedades de manzana 'Golden Delicious' y 'Cripps Pink', que son susceptibles a Alternaria spp., y se utilizaron en nuestro experimento de campo que se describe a continuación. Según los predictores, las bajas concentraciones de azufre se asociaron consistentemente con una mancha foliar más grave en ambas variedades (Fig. 2a). Sin embargo, el azufre y el magnesio fueron fuertemente colineales en el conjunto de datos (r = 0,78, Figura complementaria 4) y no podemos excluir un papel potencial para el magnesio, a pesar de que la selección del modelo (basada en AIC) apoyó firmemente al azufre como elemento impulsor (Resultados complementarios). S1). Además, las bajas concentraciones de manganeso también se asociaron con una alta gravedad de la mancha foliar, pero sólo para 'Golden Delicious' (Fig. 2b). Para validar estos resultados con datos independientes, comparamos el estado nutricional de las hojas en huertos emparejados de 'Golden Delicious' en el área de estudio con una incidencia alta o baja de mancha foliar en años anteriores. Este análisis mostró que los huertos de alta incidencia estaban asociados con concentraciones bajas de azufre en las hojas, magnesio y especialmente manganeso (Resultados complementarios S2, Figuras complementarias 7 y 8).

Relaciones entre la gravedad de la mancha foliar y las concentraciones de nutrientes en las hojas. Se encontró una relación significativa para el azufre (a) y el manganeso (b). Tenga en cuenta que la mancha foliar se representa en una escala logarítmica. Se instalaron líneas separadas para las variedades de manzanas 'Golden Delicious' (naranja) y 'Cripps Pink' (rosa). Las líneas gruesas de colores muestran la regresión ajustada y las líneas de puntos, los SE. Las líneas de puntos grises se muestran únicamente como ayuda visual. Consulte los Resultados complementarios S1 para obtener un análisis detallado.

A continuación, estudiamos la biología de la infección de la enfermedad de Alternaria. Probamos en condiciones controladas si Alternaria spp. puede infectar el tejido de hojas y frutos sanos o lesionados. Inicialmente, se realizó un ensayo de disco foliar utilizando una suspensión de esporas (1,25 × 106 esporas/ml) de cuatro Alternaria spp distintas. aislados (dos A. alternata sspp. tenuissima y dos A. alter sspp. arborescens, según la clasificación de Armitage et al. 2015) que se aislaron originalmente de la mancha foliar y la mancha del fruto en manzanas. Sin embargo, este ensayo no resultó en necrosis foliar ni en tejido sano ni en discos foliares dañados manualmente con alicates (Figura complementaria 9; Tabla complementaria 7). No encontramos indicios de una infección (coloración amarillenta o marrón de la epidermis de la hoja), a pesar de que los aislados desarrollaron un micelio denso en la parte superior de la superficie del disco de la hoja (Figura complementaria 1f). Sólo cuando las hojas habían sido previamente atacadas y dañadas por ácaros rojos europeos (Panonychus ulmi; hojas chupadoras y dañinas), se formaron necrosis (Figura complementaria S9).

En un segundo ensayo de laboratorio, inoculamos artificialmente manzanas con una densa suspensión de esporas de Alternaria spp. (A. alternata sspp. arborescens; 1,25 × 106 esporas/ml), que se aisló originalmente de frutos infectados. Después de 12 días en la cámara climática (25 °C), no detectamos manchas en el fruto ni signos de infección (manchas necróticas, moho) (Figura complementaria 10). Esto también fue cierto cuando las manzanas tenían heridas frescas, no necróticas, que, según la literatura, deberían facilitar una infección7. En un tercer ensayo, investigamos si las manchas de fruta pueden expandirse en número y tamaño durante el almacenamiento (temperatura ambiente, ~ 15–20 °C). Para ello, los frutos infectados y sanos se almacenaron juntos durante dos meses en cajas, teniendo superficie de contacto. Aquí, las frutas sanas (control) no desarrollaron ninguna mancha y la cantidad de manchas en las frutas infectadas no cambió durante el almacenamiento (Figura complementaria 11). Por lo tanto, las manchas de los frutos no aumentaron en número ni tamaño durante el almacenamiento.

En resumen, nuestro estudio encontró que bajo condiciones controladas, nuestros aislados de Alternaria (A. alternata sspp. tenuissima y A. alter sspp. arborescens) no fueron capaces de infectar tejido sano o heridas frescas, ni tampoco pudieron reproducir los síntomas de la enfermedad foliar. Mancha y mancha de fruto ni en hojas ni en frutos.

Investigar el papel de la necrosis foliar en Alternaria spp. ocurrencia, realizamos un experimento de campo en julio de 2019 en árboles 'Golden Delicious'. Indujimos manchas foliares utilizando un herbicida (carfentrazona-etil) y examinamos si esto conducía a la aparición de Alternaria spp. En septiembre, la densidad de esporas de Alternaria fue en promedio 14 veces mayor en las manchas foliares inducidas por herbicidas que en la mancha foliar de Alternaria natural (Figura complementaria 12). En octubre, la densidad de esporas había aumentado en la mancha foliar natural de Alternaria, pero aún era considerablemente (2,7 veces) menor que en las manchas foliares inducidas por herbicidas (Tabla complementaria 8), lo que indica que las necrosis preexistentes son una condición previa importante para colonización y que Alternaria spp. Posteriormente sigue la propagación de la necrosis.

Para validar nuestra hipótesis, llevamos a cabo un experimento de campo de tres años en huertos de manzanos. En árboles maduros de las variedades 'Golden Delicious' y 'Cripps Pink', aplicamos fertilizantes foliares a base de azufre hechos a medida sin efecto fungicida (probados con detección de actividad fungicida in vitro, Tabla complementaria 1, Figura complementaria 15), comúnmente utilizaron fungicidas, o ninguno de los dos (control), bajo prácticas de cultivo convencionales ('producción integrada'). Durante tres años, los fertilizantes foliares redujeron la mancha foliar por Alternaria en un promedio de 72,7% (SE: ± 2,5) para ambas variedades de manzanas (Fig. 3, p <0,001; Tabla complementaria 2). Esta reducción fue la misma que la lograda por los fungicidas de uso común (72,7%, SE: ± 3,3). Los fertilizantes foliares a base de azufre también redujeron las manchas de frutos en 'Golden Delicious' (50,2%, SE: ± 7,3, p < 0,001, Tabla complementaria 3), mientras que los fungicidas condujeron a una reducción del 75,9% (SE: ± 4,6) en promedio. (Fig. 3, p <0,001; Tabla complementaria 2). Por el contrario, las manchas en los frutos en 'Cripps Pink' fueron raras (una incidencia 111 veces menor que en 'Golden Delicious') y no se pudo detectar un efecto reductor de los fertilizantes foliares sobre las manchas en los frutos (p = 0,721). Para 'Golden Delicious' encontramos una correlación positiva entre la mancha foliar y las manchas del fruto en los tres años (r = 0,53 a 0,78, Figura complementaria 3; Tabla complementaria 4).

Reducción relativa de la mancha foliar y de los frutos asociada a Alternaria utilizando fungicidas o fertilizantes foliares a base de azufre (SBF). Se muestra la efectividad del fungicida y del SBF en las dos variedades de manzanas 'Golden Delicious' (naranja; fertilizante: Sulfate-Mix) y 'Cripps Pink' (Pink Lady®'; rosa; fertilizante: azufre microfino) en comparación con la práctica convencional (control, puntos línea en cero). La prueba de campo se realizó en un diseño de bloques aleatorios (n = 4 por tratamiento) de 2017 a 2019 en el Centro de Investigación Laimburg, Tirol del Sur, Italia. La reducción de las manchas foliares en ambas variedades fue significativa en todos los años (p < 0,0001, Tabla complementaria 2), mientras que la reducción de las manchas en los frutos solo fue significativa para 'Golden Delicious' (Tabla complementaria 3). Las manchas de fruta en 'Cripps Pink' fueron muy raras o ausentes (control: número medio de manchas de fruta-1 ± SE: 0,0092 ± 0,0049; consulte la Fig. 14 complementaria), lo que hizo inapropiado calcular las reducciones relativas.

Con base en nuestro estudio, hemos encontrado evidencia que desafía la noción ampliamente extendida de que Alternaria spp. es la causa principal y directa de la mancha foliar por Alternaria en la manzana y sugiere que la enfermedad es más compleja de lo que se pensaba anteriormente. Nuestros hallazgos contradicen la idea de que el hongo actúa como un patógeno primario, ya que la inoculación artificial de tejido sano falló y las manchas de la fruta no se expandieron durante el almacenamiento. Además, observamos una fuerte asociación entre las bajas concentraciones de nutrientes en las hojas y la incidencia de enfermedades.

Además, nuestro estudio demostró que los fertilizantes foliares simples a base de azufre, que no inhiben el crecimiento de hongos, pueden reducir la mancha foliar por Alternaria con la misma eficacia que los fungicidas. Dado que los fertilizantes fortalecen la condición fisiológica de la planta y no actúan directamente sobre el hongo, sugerimos que trate la causa principal de la enfermedad y que la infección por Alternaria sea un síntoma secundario. Con base en esto, proponemos la nueva síntesis de que la mancha foliar fisiológica y la mancha foliar por Alternaria no son enfermedades distintas, sino más bien parte de un continuo, que llamamos "complejo de Alternaria". Esta concepción del continuo reconoce la naturaleza multifactorial de la inducción y proliferación de la enfermedad y resalta la importancia de considerar los factores fisiológicos y fúngicos involucrados en el desarrollo de la enfermedad (Fig. 1).

Sostenemos que las ubicuas esporas de Alternaria colonizan cualquier necrosis foliar preexistente y no pueden iniciar esta necrosis por sí solas. En cambio, las manchas foliares iniciales son causadas principalmente por desequilibrios de nutrientes en las hojas (Fig. 1c-i). Sin embargo, las necrosis foliares iniciales también pueden formarse a través de otros mecanismos; por ejemplo, determinados agentes activos pulverizados durante condiciones climáticas particulares pueden tener efectos fitotóxicos (Fig. 1c-ii)37,38,39. Independientemente de la causa de las manchas foliares iniciales, las ubicuas esporas de Alternaria colonizarán posteriormente y ampliarán las necrosis existentes (Fig. 1c-iii), potencialmente mediante la liberación de toxinas (p. ej., alternariol, altenueno, ácido tenuazónico), lo que provocará una defoliación prematura. y pérdida de rendimiento 40,41,42,43,44. El mismo mecanismo probablemente se aplica a la formación de manchas en los frutos y Alternaria spp. sólo puede colonizar las lenticelas predañadas. (Figura 1d). Este papel patogénico oportunista de Alternaria spp. La progresión de la enfermedad explica por qué diferentes fungicidas también reducen los síntomas en hojas y frutos, pero una infección primaria por Alternaria no es la causa inicial.

Esta síntesis representa una mejora significativa con respecto a las hipótesis originales en competencia, ya que proporciona una explicación integral de los resultados inconsistentes y complejos relacionados con la enfermedad de Alternaria (consulte el suplemento "Discusión: dos hipótesis inadecuadas").

Queremos reconocer que nuestros experimentos de infección se realizaron en condiciones controladas y con un número limitado de aislamientos y, por lo tanto, representan solo una fracción de las posibles interacciones entre Alternaria spp. y la planta huésped de la manzana. Además, existe una variabilidad significativa en los resultados de otros experimentos de infección con Alternaria spp., donde algunos estudios han informado de una inoculación artificial fallida sin síntomas o inconsistencias14,45,46,47, mientras que otros han informado de una inoculación exitosa con síntomas15,48,49. 50. La patogenicidad variable (infección exitosa versus fallida) de Alternaria spp. Normalmente se explica por “patotipos” de cepas de Alternaria, específicamente A. alternata, que pueden producir diferentes metabolitos, como toxinas específicas del huésped que actúan como factores de virulencia o factores de colonización como el ácido tenuazónico y el alteraniol41,42,51,52. Estas toxinas pueden desencadenar muerte celular y necrosis en cuestión de horas cuando se aplican directamente al tejido vegetal40,44,53. Desafortunadamente, nuestro estudio de inoculación artificial se realizó sin caracterización metabólica de los aislados utilizados, y el fracaso de la inoculación puede deberse a una menor virulencia de estos aislados54.

Dado el estado actual de la investigación sobre Alternaria, creemos que es importante reexaminar el énfasis puesto en las toxinas y las pruebas de toxicidad, particularmente en lo que respecta a la caracterización de la virulencia en Alternaria spp. y para el cumplimiento de los postulados de Koch. Creemos que es necesario un examen crítico de este método para garantizar una interpretación precisa de la biología de la infección de Alternaria spp. En los “bioensayos de hojas separadas” o “bioensayos de patogenicidad”, este efecto directo de la toxina se utiliza para inferir la patogenicidad (patotipo versus no patotipo) de las cepas de Alternaria9,55,56. Sin embargo, estos ensayos pueden plantear algunos desafíos porque (a) no rastrean el proceso biológico de la infección, es decir, la germinación de las esporas y la invasión de las hifas en el tejido del huésped para “establecer contacto y obtener nutrientes”1. Esto se debe a que los ensayos de patogenicidad generalmente se realizan en tejido herido, a veces con toxinas purificadas y sin el hongo9,23,40,42,48,53,55,57. Además, (b) las necrosis foliares provocadas en estos ensayos (venosa, necrosis extensa) son sintomáticamente muy diferentes de la mancha foliar en el campo (manchas concéntricas)45,46,55,56,58. Finalmente, (c) estas necrosis permanecen constantes en tamaño y no aumentan de tamaño cuando se utilizan tapones miceliales como inóculo47,48. En general, es importante reconocer que los ensayos de patogenicidad tienen limitaciones cuando se trata de determinar si Alternaria spp. puede infectar eficazmente las plantas hospedantes. Además, vale la pena señalar que no hay evidencia definitiva de infección primaria (es decir, la penetración de hifas en tejido sano) por Alternaria spp. en plantas de manzano. Las diferencias entre el “efecto toxina”, la “infección”, el “patógeno secundario” y el “patógeno primario” pueden parecer sutiles, pero para evitar un tratamiento ineficaz, es fundamental comprender la biología de la infección de un patógeno. Para Alternaria, la práctica actual ha llevado a una clasificación errónea de un patógeno secundario oportunista como patógeno primario, lo que ha llevado a un tratamiento innecesario e inespecífico con fungicidas.

Es importante destacar que existe una fuerte analogía entre la “enfermedad de Alternaria” en la manzana y la “enfermedad de Alternaria” en otros cultivos. En la papa, las esporas de Alternaria solani, que se cree que causan el tizón temprano, se producen principalmente en las hojas muertas o moribundas7. Además, el tizón temprano también se asocia con estrés por calor y deficiencia de nutrientes59,60. En varios cultivos, los tratamientos con fungicidas tienen poca eficacia, mientras que las aplicaciones de magnesio (papa, amapola) y zinc (tomate) controlaron el tizón temprano, lo que indica que aquí puede operar un mecanismo fisiológico similar al de la manzana. Asimismo, la aplicación foliar de MgSO4 en la amapola redujo la gravedad de la enfermedad de diferentes hongos del moho, incluida Alternaria brassicae f. somnífero61. En el caso del algodón, se ha demostrado que el estrés por frío es el principal factor predisponente a una infección por A. alternata3. En resumen, varios estudios han demostrado que Alternaria está relacionada con deficiencia de nutrientes o que la infestación puede controlarse con fertilizantes62,63,64,65,66,67, pero también otros estreses están relacionados con Alternaria spp., como sequía, senescencia, Daños por virus e insectos o estrés por frío 3,7,68,69,70,71. Por lo tanto, varios estreses vegetales abióticos y bióticos (por ejemplo, ácaros en nuestros resultados) pueden desencadenar la colonización por Alternaria spp. también en otras plantas.

La asociación de Alternaria spp. a diferentes tipos de estrés suele explicarse por una mayor susceptibilidad debido a un huésped “debilitado”2,7. Sin embargo, el término "debilitado" aborda varios cambios en los procesos fisiológicos, como los mecanismos de respuesta al estrés 72,73,74. La hipótesis del huésped "debilitado" también implica que puede producirse una infección o penetración en el tejido vegetal fresco, lo que no coincide con el estilo de vida saprofito de Alternaria spp.1,2,7. Por el contrario, planteamos la hipótesis de que el tejido vegetal muerto es la condición previa clave para la colonización de Alternaria spp. en manzanas y probablemente también en otras plantas. La nueva hipótesis explica por qué se asocia una amplia gama de diferentes estreses con Alternaria spp.: todos estos estreses conducen a una necrosis que puede ser posteriormente colonizada por Alternaria spp., un hongo principalmente saprofito.

Somos conscientes de las interacciones multifactoriales entre diferentes especies de Alternaria, diferentes plantas hospedantes y diversos cultivares. Aunque no analizamos todas las variedades susceptibles, creemos que nuestros resultados son representativos, ya que la mayoría de estas variedades están relacionadas genéticamente y es probable que la dinámica de la enfermedad sea similar. Por otro lado, una gran cantidad de investigaciones se están centrando en la “patogenicidad” de diferentes especies/aislados de Alternaria (patotipos) centrándose en las toxinas producidas o los loci de genes relacionados6,44,75,76,77,78. Se han descrito numerosas fitotoxinas de Alternaria y recientemente se descubrió que se produce una nueva toxina putativa en 14 aislados diferentes44,79. La nueva toxina no estaba relacionada con regiones genéticas conocidas de la toxina de Alternaria (AMT1, AMT4, AMT14), lo que subyace a la complejidad de la investigación sobre la patogenicidad de Alternaria. Sin embargo, sostenemos que la tipología del patotipo y su potencial para producir toxinas no pueden explicar por qué los fungicidas y los tratamientos con fertilizantes redujeron igualmente los síntomas. Implicaría que todos los diferentes tipos de fertilizantes y nutrientes (ver referencias anteriores; N, P, K, Mg, Zn, S, Mn) pueden "inactivar" múltiples y altamente efectivas toxinas (necrosis en pocas horas) cuyas células Se cree que el efecto dañino es el proceso clave para la infección 40,41,80,81 (consulte también la "Discusión" complementaria).

Aunque es necesario investigar más a fondo las causas fundamentales de los desequilibrios de nutrientes de las hojas, los factores climáticos y, en particular, las olas de calor y las consiguientes caídas de temperatura han sido implicados como factores clave17,31. El aumento de las temperaturas y una frecuencia cada vez mayor de períodos de calor y climas extremos en la región de estudio son consistentes con la mayor frecuencia y distribución espacial (confinada a los fondos cálidos de los valles) de la mancha foliar por Alternaria y la primera aparición de manchas en los frutos hace 22 años (en 1999). 82. Además, la continua expansión de la mancha foliar a regiones de climas templados (menos cálidos) apunta al cambio climático como un factor clave 23. Sin embargo, los mecanismos ambientales y fisiológicos responsables de la baja disponibilidad, absorción, lixiviación o secuestro de Mn, S y Mg siguen siendo deficientes. comprendido. El estado hídrico variable del suelo (sequía versus anegamiento) y los regímenes de riego desequilibrados pueden ser impulsores potenciales, ya que influyen fuertemente en la disponibilidad de nutrientes, en particular manganeso 35. Es importante destacar que si el complejo de Alternaria está realmente impulsado por fenómenos meteorológicos extremos inducidos por el cambio climático, su La importancia para la producción de manzanas probablemente aumentará sustancialmente en un futuro próximo.

En resumen, nuestros resultados muestran que Alternaria spp. no es la causa principal de la mancha foliar y de los frutos por Alternaria, sino un patógeno oportunista. Alternaria spp. sólo coloniza el tejido necrótico preexistente de las hojas y frutos del manzano. Estas necrosis preexistentes son causadas por un trastorno fisiológico de los nutrientes (que involucra S, Mn y Mg), que aparece primero como una mancha foliar fisiológica. Sin embargo, también otras causas (p. ej. ácaros rojos, fitotoxicidad de agentes activos) pueden desencadenar necrosis iniciales y actuar así como condición previa para la colonización por Alternaria spp. Finalmente, demostramos que los fertilizantes foliares a base de azufre pueden usarse como un método preventivo simple para controlar las enfermedades asociadas a Alternaria. La aplicación de estos fertilizantes foliares puede reducir considerablemente el uso mundial de fungicidas en la producción de manzanas. El impacto potencial se verá fuertemente exacerbado si los mismos mecanismos también se aplican en otros cultivos, como suponemos, y también pueden tratarse mediante un tratamiento con fertilizantes foliares.

Todas las pruebas de campo se realizaron entre 2017 y 2019 en los huertos de manzanos del Centro de Investigación de Laimburg, Tirol del Sur, Italia (224 msnm; 46,3825°/11,2887°). Establecimos nuestros experimentos en dos bloques, el bloque 'Golden Delicious' (plantado en 2012) y el bloque 'Cripps Pink' ('Pink Lady®') (plantado en 2000). Se orientaron hileras de manzanos maduros de norte a sur y se cultivaron como husos delgados de 3,5 m de altura. Configuramos los experimentos como un diseño de bloques aleatorios con 4 repeticiones, donde una fila constituye un bloque. Para minimizar la influencia de los tratamientos vecinos, incluimos dos "filas de amortiguamiento" entre los bloques. Las parcelas dentro de una manzana estaban compuestas por 15 árboles consecutivos. Los tres primeros y los tres últimos árboles de una parcela, limítrofes con las otras parcelas, no fueron considerados para la evaluación.

Para la evaluación de los tratamientos (ver más abajo), se recolectaron frutos y hojas durante los períodos de cosecha comunes (Golden Delicious: 19 de septiembre de 2017, 19 de septiembre de 2018, 26 de septiembre de 2019; 'Cripps Pink': 7 de noviembre de 2017, 8 de noviembre de 2018, 15 de noviembre de 2019). De cada parcela recolectamos al azar dos cajas de manzanas (~ 50–65 manzanas por caja), una para cada lado del árbol (oeste y este). Los frutos se transfirieron inmediatamente a la celda de almacenamiento en frío (2,5 °C y 90% HR) hasta su posterior evaluación. Se recolectaron hojas al azar el mismo día de los mismos árboles, 100 hojas por parcela (réplica) divididas en partes iguales sobre los lados del árbol (50 hojas por lado) y se colocaron en bolsas de papel. Para cuantificar la mancha foliar por “Alternaria”, cada hoja se analizó visualmente en el laboratorio y se asignó a una clase de infestación, correspondiente al área necrótica porcentual de una hoja (0%, 0–5%, 5–10%, 10–15%, 15–20%, 20–30%, > 30%). Las frutas también se asignaron a clases de infestación, considerando el número de manchas detectadas en la fruta por manzana (0, 1–2, 3–5, > 5). Los resultados se agruparon para cada parcela, representando una réplica/punto de datos. La mancha del fruto estuvo casi ausente en el tratamiento con fungicidas de 'Cripps Pink' y por lo tanto no fue evaluada.

Los huertos se manejaron de acuerdo con las directrices para el cultivo integrado de frutas de pepita, con la excepción de que no se aplicaron fertilizantes ni agentes activos específicos de Alternaria83. Así, nuestras parcelas de control representan un manejo integrado sin tratamientos específicos de Alternaria, mientras que las otras parcelas experimentales fueron: manejo integrado más el tratamiento experimental correspondiente. Los tratamientos probados se desarrollaron en base a resultados previos y observaciones de campo (ver Figura complementaria 13). Nuestro tratamiento contra la mancha foliar por Alternaria fue para Golden Delicious la mezcla de sulfato (SBF, consulte la Tabla complementaria 1 para ver la composición). Para 'Cripps Pink' utilizamos en 2017 la suspensión de azufre Thiopron® (UPL Italia srl; 2017: 0,605 l/hl = 500 g S/hl). Como Thiopron® provocaba una capa blanca en las manzanas, en conflicto con los criterios de venta, redujimos la cantidad aplicada en 2018 (0,242 l/hl = 200 g S/hl) y sustituimos en 2019 Thiopron® por otro producto de azufre común (azufre microfino). ), Thiovit® (spa Syngenta Italia). Se aplicó Thiovit® según la dosis recomendada (240 g/hl = 190 g S/hl). Este cambio a otro producto de azufre no tuvo una influencia fundamental en nuestros resultados, ya que el efecto sobre la mancha foliar es independiente del tipo/producto de azufre (ver Figura complementaria 13). A todos los tratamientos descritos anteriormente los denominaremos “fertilizante foliar a base de azufre” (SBF). La frecuencia de aplicación por temporada fue para Golden Delicious 4 aplicaciones en 2017 y 5 aplicaciones en 2018 y 2019. Para 'Cripps Pink', la frecuencia de aplicación fue 6 veces por temporada en los tres años (2017-2019; consulte la Tabla complementaria 1). Todos los tratamientos se aplicaron mediante un aspersor experimental (ventilador axial, boquillas inyectoras) con una cantidad de agua usada de 15 hl/ha.

Para comparar la efectividad del SBF con la práctica actual, también monitoreamos los tratamientos en los que se aplicaron varios fungicidas para controlar la mancha foliar y la mancha del fruto por Alternaria. Probamos dos agentes activos con dos modos de acción diferentes en 'Golden Delicious': (I) fosfonato de potasio (código FRAC: P 07; 2017: “FosfiD'oR 250”, Orius; 2018-2019: “Century Pro”, BASF ) y (II) Difenoconazol (código FRAC: 3; 2017-2019: “Score 10 WG”, Syngenta). Las dosis aplicadas fueron: FosfiD'oR 250: 3 L/ha (45,3% Fosfonato de potasio), Century Pro: 1,9 L/ha (50,4% Fosfonato de potasio), Score 10 WG.: 750 g/ha (10% Difenoconazol). Cada uno de estos fungicidas se probó por separado. Como 'Cripps Pink' tiene un período de crecimiento mucho más largo (cosecha en noviembre) y la frecuencia de aplicación está limitada por las regulaciones legales para cada agente activo a un número determinado, probamos un tratamiento con Fungicida-Mix. La Mezcla-Fungicida incluyó los siguientes fungicidas: Syllit® 65 (UPL), con 1,38 kg/ha (65% Dodine), Polyram® DF (BASF), con 2,6 kg/ha (70% Metiram), Geoxe ® (Syngenta), con 0,45 kg/ha (50% Fludioxonil). Todos los fungicidas se aplicaron según buenas prácticas agrícolas, generalmente después de las lluvias, cuando el riesgo de infecciones fúngicas es alto. La frecuencia de tratamiento de fungicidas por temporada de crecimiento fue para 'Golden Delicious' 2017: 8, 2018: 5, 2019: 11 y para 'Cripps Pink': 2017: 11, 2018: 7, 2019: 8. Para estadísticas, resultados de todos Se incluyeron parcelas de fungicidas y, por lo tanto, representan un efecto promedio de diferentes fungicidas ('Golden Delicious': 2 agentes activos; 'Cripps Pink': 4 agentes activos).

Dentro de nuestra prueba de campo (configuración experimental como se describe anteriormente), probamos en 2017 además el efecto de diferentes fertilizantes foliares y concentraciones de fertilizantes sobre la mancha foliar. Los fertilizantes utilizados fueron: Thiopron® (UPL Italia srl), Fytofert® S (Desangosse Italia srl), Sulfate-mix (ver Tabla S1). Los tres fertilizantes se aplicaron en dos concentraciones diferentes, las cuales siempre se corrigieron para recibir una concentración final de 50 g de azufre hl-1 y 500 g de azufre hl-1 (Thiopron®: 61 ml hl-1 y 606 ml hl-1, 68 ml hl-1 y 685 ml hl-1, Mezcla de sulfato: 500 g S hl-1 como se describe en la Tabla S1, para 50 g S hl-1 reducimos MgSO4 a 318,8 g hl-1.

Para probar si la mezcla de sulfato (S-Mix, consulte la Tabla complementaria 1) tiene un efecto fungicida sobre Alternaria spp., realizamos una detección de actividad fungicida en el laboratorio. Para eso, utilizamos placas de microtitulación de 6 × 4 en las que llenamos PDA como control, PDA mezclado con S-Mix (PDA + S-Mix) en su concentración aplicada en campo (ver arriba) y PDA mezclado S-Mix con 1 /10 del mismo utilizó concentración (PDA + 1/10 S-Mix). Los tres medios (PDA, PDA + S-Mix, PDA + 1/10 S-Mix) se inocularon con cuatro aislados diferentes de Alternaria (A02/F172, A02/F152, A15/271, A15/31) con tres réplicas cada uno ( 9 pocillos por aislado). Después de la inoculación, las placas se transfirieron a una incubadora a 25 °C. El crecimiento del micelio (diámetro, mm) se midió después de 24 h con una regla y se comparó con el control (PDA). De cada réplica se determinó el diámetro con dos mediciones en disposición ortogonal (réplicas técnicas). El crecimiento del micelio no se redujo en 1/10 de S-Mix y S-Mix en los medios (PDA), pero aumentó ligeramente (p <0,001; Figura complementaria 13). Las interacciones entre los medios (concentración) y los aislados fueron significativas (p = 0,007) ya que el crecimiento de un aislado (A02/F172) no mostró diferencias entre las concentraciones. Por tanto, S-Mix no tiene efecto fungicida.

Para el análisis de nutrientes tomamos muestras de hojas de diferentes parcelas/tratamientos dentro de nuestra prueba de campo (2017 a 2019). Durante los tres años tomamos muestras de alrededor de 9900 hojas de 891 árboles tomados de 99 parcelas para 'Golden Delicious', para 'Cripps Pink' esto fue respectivamente 9100, 819 y 91. Combinamos todas las hojas recolectadas de una parcela, por lo que cada parcela representa un replicar y un punto de datos en el análisis estadístico posterior. Se evaluó la mancha foliar en todas las hojas como se describió anteriormente y posteriormente se analizó la concentración de nutrientes. Para ello, las hojas (100 por parcela) se secaron en una estufa a 60 °C durante al menos 72 h en un compartimento secador y se eliminaron los pecíolos antes del análisis. El análisis químico fue realizado por el Laboratorio de análisis de suelos y plantas de Laimburg (acreditado según la norma ISO 17025:2005). El nitrógeno se analizó con un analizador elemental según DIN EN ISO 16634-1:2009 (según Dumas). Otros nutrientes (P, K, Ca, Mg, B, Fe, Mn, Cu, Zn, S) se analizaron con espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) de acuerdo con EPA 3052 1996 + EPA 6010D 201. Todas las concentraciones de nutrientes dadas son por “peso seco”.

Los huertos de manzanos pueden diferir dramáticamente en la prevalencia de la infestación de la mancha foliar por Alternaria y de las manchas de los frutos, incluso si los huertos están cerca y son de la misma variedad de manzanas. Para validar nuestro análisis de nutrientes de las hojas, seleccionamos cuatro pares de huertos 'Golden Delicious'. Para minimizar la influencia del manejo, los pares de huertos se seleccionaron basándose en dos criterios: (I) cada par fue manejado por el mismo agricultor (tres agricultores) y (II) cada par de huertos consistía en un huerto que mostraba los últimos ~ 5 años ninguna infestación o sólo una infestación mínima y un huerto caracterizado por una infestación regular muy fuerte (abundancia natural). Un par no cumplió el criterio I), ya que emparejamos los huertos de Laimburg con un huerto externo. De cada huerto, se tomaron muestras de hojas tres veces en 2018 (25 de mayo, 20 de julio, 7 de septiembre) y dos veces en 2019 (17 de mayo, 9 de julio), con dos réplicas por huerto y momento y 50 hojas de 15 árboles por réplica. En la primera fecha de muestreo (25 de mayo de 2018) tomamos tres réplicas por huerto. Se analizó la concentración de nutrientes de las hojas, como se describió anteriormente.

Todos los aislados utilizados en el estudio se obtuvieron de la colección de cultivos de hongos en Laimburg y se aislaron inicialmente de manchas de hojas de manzano y de frutas en varios huertos ubicados en Tirol del Sur, Italia. La clasificación filogenética de los aislados se determinó mediante el método propuesto por Armitage et al. en 2015, y los resultados revelaron que dos aislamientos pertenecían a A. alternata sspp. tenuissima, mientras que los dos aislamientos restantes pertenecían a A. alter sspp. arborescens.

Se inocularon placas de PDA (dos por aislado) con aislados de Alternaria de la colección de Laimburg y se mantuvieron en una incubadora a 25 °C. Después de una semana, cortamos un cubo de 1,5 cm3 del micelio crecido y lo trituramos en un mortero con 200 µl de solución de tween estéril al 0,03%. Después de que el micelio estuvo completamente triturado, agregamos 4,8 ml de solución de tween al mortero. Se pipetearon 750 µl de la suspensión de micelio a placas V8 (4 placas por aislado), que previamente se cubrieron con discos de celofán empapados (agua esterilizada). Las placas cerradas (parafilm) se mantuvieron en una cámara climática a 25 °C y un programa de iluminación de 8 h de luz negra (Philipps TL-D 36W BLB 1SL/25) y 16 h de oscuridad. Después de 3 semanas, se eliminó la capa de celofán-micelio con unas pinzas y se unió con 8 ml de solución de tween en un tubo Falcon de 50 ml (dos placas por tubo). Los tubos Falcons se agitaron durante un minuto, se colocaron durante 5 minutos en un baño ultrasónico (40 kHz) y nuevamente se agitaron durante 1 min. Para separar el micelio de las esporas, el contenido del tubo Falcon se filtró posteriormente (malla de 80 µm) y la parte líquida resultante se analizó mediante hemocitómetro (cámara de recuento de Fuchs-Rosenthal) para determinar la densidad de las esporas. Todas las suspensiones de esporas se diluyeron hasta una densidad final de 1,25 x 106 esporas/ml.

Con este experimento quisimos probar la influencia de diferentes lesiones foliares en la infección por Alternaria spp. Hubo cuatro tipos diferentes de tratamientos de daño foliar: “ninguno” = tejido sano, “1 h antes” = lesionado con un alicate combinado una hora antes de la inoculación, “7 días antes” = lesionado con un alicate combinado 7 días antes de la inoculación, “Ácaros” = hojas recolectadas el día de la inoculación de un huerto actualmente atacado gravemente por ácaros rojos europeos (Panonychus ulmi). Estas hojas recolectadas tenían un daño visible por ácaros. Todas las hojas se recolectaron del huerto del Centro de Investigación de Laimburg, excepto las hojas atacadas por ácaros provenientes de una granja cercana (~ 3 km de distancia).

Para el tipo de lesión “7 días antes”, las hojas de 'Golden Delicious' se marcaron y dañaron en los árboles con un par de alicates, 7 días antes de que comenzara el experimento. Las hojas dañadas, las hojas sanas y las hojas dañadas por ácaros se recolectaron en la mañana de la inoculación experimental (29 de mayo de 2019) y se utilizaron para cortar discos de hojas con un barrenador de corcho (15 mm de diámetro). Se cortaron al azar cuatro discos por hoja, evitando la inclusión de la nervadura central. Para reducir la posible presencia de otros patógenos y mohos, los discos se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 3% y en una solución de etanol al 70%, cada uno durante dos segundos y se lavaron durante 10 segundos en agua esterilizada. Posteriormente se lesionaron los discos foliares pertenecientes al tipo de lesión “1 h antes” con un par de alicates. Seleccionamos cuatro aislamientos diferentes, que pertenecían a los clados A. alternata sspp. tenuissima (A18/F01/14, A18/F03/09) y dos A. alternata sspp. arborescens (A18/F05/11, A18/F10/14; según Armitage et al.75) Los aislados se aislaron originalmente de diferentes huertos infestados del Tirol del Sur. Nuestra configuración experimental fue un diseño completamente cruzado de los factores "Tipo de lesión" y "aislamientos" del factor, ambos con cuatro aislamientos diferentes, lo que resultó en 16 combinaciones de tratamientos. Utilizamos cuatro réplicas para cada combinación de tratamientos (cuatro placas de Petri), que constan de cuatro réplicas técnicas (cuatro discos por placa).

Se llenaron pequeñas placas de Petri (55 mm de diámetro) con una capa de perlas de vidrio esterilizadas en autoclave (3 mm de diámetro) y agua estéril (3 ml) hasta que las perlas quedaron cubiertas. En cada plato disponemos 4 discos de hojas, correspondientes al mismo tratamiento. Según los cuatro aislados tuvimos cuatro suspensiones de esporas diferentes de las cuales aplicamos 60 µl con una pipeta en la lesión de cada disco foliar (centro). Como control (n = 4), utilizamos agua esterilizada que aplicamos como se indica arriba en los discos foliares de cada "Tipo de lesión". En conclusión, cada placa de Petri incluyó discos de hojas de un “Tipo de lesión” y un aislado o agua pura (control; en total 5 tratamientos × 4 aislados × 4 réplicas = 80 placas). Posteriormente, las placas de Petri se colocaron en una cámara climática (Proclimatic ACLIL 900 Lt) a 25 °C, 65 % HR y un programa de iluminación de acuerdo con la duración del día concurrente (15,5 h de luz/8,5 h de oscuridad, 5000 lx). Debido a la pérdida por evaporación, agregamos los días 3, 6 y 9, 2 ml de agua esterilizada a cada placa.

Después de 13 días (12 de junio de 2019), se evaluó cada disco para detectar mancha foliar necrótica de acuerdo con las siguientes clases [% de área necrótica]: 0, 0–1, 1–5, 5–10-10–15, 15–20, 20–30, > 30. La transformación en datos numéricos se realizó como se describe anteriormente (experimento de campo principal). Nota: evaluamos el cambio en el área necrótica en relación con el área necrótica de los controles correspondientes, que ya diferían antes de la inoculación debido a los diferentes tratamientos de "Tipo de lesión".

Se cosecharon manzanas maduras 'Golden Delicious' en el Centro de Investigación de Laimburg el 18 de septiembre de 2019. En el laboratorio, la superficie de la manzana se limpió con toallas de papel empapadas en una solución de etanol al 70 %. Con un rotulador se dividió la superficie de la manzana en tres segmentos esféricos iguales. Cada segmento fue asignado a uno de los tres tipos de lesión (tratamiento, n = 4): Aguja = lesionado con aguja de jeringa (5 pinchazos ~ 5 mm de profundidad), Papel de lija = lesionado con papel de lija (~ 6 cm2 de manzana lesionada superficie), Ninguno = tejido sano no tratado. Mediante un cepillo se inocularon las zonas lesionadas y el tejido sano con una suspensión de esporas (aislado A18/F10/14, A. alternata sspp. arborescens). Como control, utilizamos agua esterilizada que aplicamos de manera análoga a la suspensión de esporas en cuatro manzanas adicionales con los mismos tipos de lesiones. Las manzanas se transfirieron a una caja de plástico con toallas de papel empapadas en agua en el fondo para aumentar la humedad del aire. Las manzanas se colocaron sobre una rejilla metálica dentro de la caja para mantenerlas secas. Las cajas se cubrieron con una tapa (no hermética) colocada en una cámara climática (Proclimatic ACLIL 900 Lt, 25 °C, 65% RH) y un programa de iluminación de acuerdo con la duración del día concurrente (12 h de luz/12 h de oscuridad). Se rellenó agua los días 4 y 8 para mantener las toallas mojadas. Después de 12 días, las manzanas fueron controladas para detectar manchas en los frutos y formación de necrosis como antes.

Queríamos probar si (a) las manchas de la fruta aumentan en número y tamaño durante el almacenamiento y (b) si las manzanas sanas pueden infectarse con manzanas infectadas cercanas durante el almacenamiento. Para ello, se cosecharon manzanas 'Golden Delicious' en septiembre (fecha de cosecha común) de un huerto con una infestación grave de manchas de frutos de Alternaria (media: 10 manchas por manzana). Se tomaron manzanas sanas de otro huerto sin infestación. Se colocaron manzanas sanas sin manchas junto con las manzanas infectadas en cajas de plástico (27 de septiembre de 2000). Ambas cajas se almacenaron a temperatura ambiente (15–20 °C), una a 65% de HR (10 manzanas infestadas, 15 sanas) y la otra a 100% de HR (11 manzanas infestadas, 10 sanas), respectivamente. Después de dos meses (25 de noviembre de 2000), las manzanas se controlaron nuevamente para detectar manchas en la fruta y se compararon con las anteriores al almacenamiento.

Para probar si Alternaria spp. coloniza el tejido necrótico, provocamos manchas foliares necróticas artificialmente en el campo. Para ello, se roció con un pulverizador manual el herbicida Spotlight® Plus (Belchim; carfentrazona-etil; concentración: 3 ml/l) sobre hojas de la 'Golden Delicious' en el huerto de Laimburg. Se trataron seis árboles por parcela (n = 4) el 8 de julio de 2019 dentro de nuestra prueba de campo principal. Las manchas foliares artificiales resultantes se distinguían claramente de la mancha foliar natural. Los días 3 de septiembre y 14 de octubre de 2019, se recolectaron cinco hojas por parcela con síntomas claros de las parcelas tratadas con herbicida y de las parcelas control con mancha foliar natural. Las hojas frescas recolectadas se escanearon con una fotocopiadora para crear imágenes en color (300 ppp). Con base en las imágenes en color, determinamos el tamaño (cm2) de la mancha necrótica, mediante el software ImageJ84. Después del escaneo, las hojas se secaron en bolsas de papel a 60 °C durante al menos 72 h en un secador de compartimento. A continuación, se lavaron las esporas de las hojas secas de la siguiente manera: se trituraron las hojas secas de una parcela y se llenaron juntas en un vaso de precipitados de 200 ml con 60 ml de agua desionizada, cada una. Los vasos se agitaron durante 2 min (200 rpm), posteriormente se transfirieron durante tres minutos a un baño de ultrasonidos (40 kHz) y se agitaron nuevamente durante 5 min (200 rpm). La mezcla de agua y hojas se filtró (malla de 80 µm) y el filtrado resultante se utilizó para analizar la densidad de esporas mediante un hemocitómetro (cámara de conteo de Fuchs-Rosenthal).

Los siguientes análisis se basaron en análisis del modelo lineal de efectos mixtos (LMM). Todos los análisis se realizaron en R versión 4.0.2 (R Core Team, 2019). Los análisis de Random Forest se ejecutaron utilizando el paquete randomForest versión 4.6-1485. Los modelos lineales mixtos se ajustaron utilizando nlme versión 3.1-148, y el análisis de componentes principales se realizó utilizando el paquete vegano versión 2.5-686,87.

Para el análisis gráfico y estadístico, los datos ordinales de mancha foliar y mancha de fruto se transformaron en datos continuos (porcentaje), utilizando los puntos medios de clase para calcular las medias ponderadas (área necrótica media [%], número medio de manchas de fruto por manzana) para cada lado del árbol de una parcela. La reducción de la mancha foliar y de las manchas del fruto se calculó mediante: (Tratamiento del área necrótica media / Control del área necrótica media)-1)*100.

El efecto del SBF y los fungicidas (tratamientos) sobre la mancha foliar y la mancha del fruto se analizaron por separado para cada uno de los dos tratamientos y cada variedad de manzana ('Golden Delicious' y 'Cripps Pink'), respectivamente. Como variables de respuesta se utilizaron “Área foliar necrótica” (%) y “Número de manchas de fruto” (# fruto-1), respectivamente. El efecto fijo fue "Tratamiento" (SBF versus control o Fungicida versus control). Como teníamos datos de varios años, especificamos "Año" (2017-2019) y Bloque (Replicar; n = 4) como efectos aleatorios anidados con pendientes separadas (Año | Bloque).

Para probar si la susceptibilidad a la mancha foliar por Alternaria está relacionada con la concentración de nutrientes (Mg, Mn, S), utilizamos LMM con concentración de Mg, Mn, S como variables de respuesta. El “tipo de huerto” (prevalencia alta versus baja) se estableció como efecto fijo. La “Fecha” (n = 5, con 2 réplicas cada una por huerto) y el “ID del huerto” (2018: n = 8; 2019: n = 6) se especificaron como efecto aleatorio con pendientes separadas (Fecha|ID del huerto).

La “densidad de esporas” de las esporas de Alternaroid extraídas de manchas foliares provocadas artificialmente (herbicida) y de la mancha foliar natural se estableció como variable dependiente. Los efectos fijos fueron el “tipo de necrosis de la hoja” (artificial versus natural) y la “fecha” de recolección de la hoja (3 de septiembre de 2019 frente al 14 de octubre de 2019) con su interacción. "Bloquear" (Replicar; n = 4) se estableció como efecto aleatorio.

Utilizamos el área foliar necrótica relativa de los discos foliares como variable dependiente. Los valores para cada réplica representan la media de las réplicas técnicas correspondientes (n = 4). “Tipo de lesión” (“ninguna” frente a “una hora antes” frente a “7 días antes” frente a “ácaros”) y “Aislar” (A18/F01/14 frente a A18/F03/09 frente a A18/F05 /11 vs. A18/F10/14) se establecieron como efectos fijos, así como su potencial interacción. "Replicar" (n = 4) se especificó como efecto aleatorio.

Para vincular las concentraciones de nutrientes en las hojas con la prevalencia de la mancha foliar, realizamos análisis de Random Forest para las variedades Golden y Pink por separado88. Para cada bosque, cultivamos 10.000 árboles y tomamos muestras aleatorias de 4 predictores para la división en cada nodo. Las variables se clasificaron según su disminución media en la impureza de los nodos, medida por sumas de cuadrados residuales, y aquellas con un impacto desproporcionado se seleccionaron para un análisis adicional después de una inspección visual.

Posteriormente, los nutrientes seleccionados se utilizaron en modelos mixtos lineales generales para probar sus efectos sobre la gravedad de la mancha foliar (transformada logarítmicamente) en las dos variedades para maximizar el poder estadístico. Se incluyeron efectos aleatorios para dar cuenta de observaciones repetidas en las mismas parcelas a lo largo de los años. Los efectos fijos incluyeron la variedad, los nutrientes foliares seleccionados y las interacciones bidireccionales entre cada nutriente foliar y variedad. Esto último permite que cada variedad tenga una relación diferente entre cada nutriente y mancha foliar. Había muy pocos datos para explorar más interacciones entre nutrientes.

Dos de los predictores seleccionados (S y Mg) eran fuertemente colineales (Figura 4 complementaria) y la inclusión de ambos en el mismo modelo condujo a estimaciones inestables de los coeficientes de regresión. Para solucionar este problema utilizamos dos enfoques. Primero, realizamos un análisis de componentes principales solo con los datos de S y Mg. El primer eje explicó la mayor parte de la variación (90,1%) en estos dos elementos, como se esperaba. Posteriormente, las puntuaciones de los ejes PCA (1 y 2) se utilizaron como predictores en el LMM (mod1, Tabla complementaria 5) para capturar simultáneamente los efectos de S y Mg en la mancha foliar. En segundo lugar, ajustamos dos LMM excluyendo Mg (mod2) o S (mod3) como predictores y comparamos el ajuste del modelo según los valores de AIC89. Simplificamos aún más el modelo de mejor ajuste (mod2), utilizando pruebas de razón de verosimilitud (mod2a).

Los materiales vegetales utilizados en este estudio procedieron de cultivos controlados y toda la recolección se realizó de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para la recolección de plantas silvestres.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles gratuitamente en: https://doi.org/10.5281/zenodo.7963642.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36760-7

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Nos gustaría agradecer a Markus Kelderer, Claudio Casera, Thomas Facchini, Gazmend Arslani y Bekir Musliu por su apoyo en el campo, Michaela Bertagnoll y Sabine Oettl por su apoyo en el laboratorio y por proporcionar/identificar los aislados. Muchas gracias a Yazmid Reyez Domingues por el diagnóstico de hongos y la discusión. Agradecemos a Martijn Bezemer y Emilia Hannula por la lectura crítica de borradores anteriores. El estudio fue financiado por el Apple Consortium South Tyrol (Terlan/Italia) (Prot. Nr. VZL.00/5881/85.00/MO-cg). ERJW recibió el apoyo de una beca de movilidad NWO-Rubicon (Organización Holandesa para la Investigación Científica, contrato n.° 019.181EN.01).

Ulrich E. Prechsl

Dirección actual: Terra Institute, Säbenertorgasse 2, 39042, Brixen, BZ, Italia

Centro de investigación Laimburg, Laimburg 6, 39040, Auer/Ora, BZ, Italia

Ulrich E. Prechsl, Werner Rizzoli y Klaus Marschall

Grupo de Agroecosistemas Sostenibles, Instituto de Ciencias Agrícolas, Departamento de Ciencias de Sistemas Ambientales, ETH Zürich, Universitätstrasse 2, 8092, Zürich, Suiza

ER Jasper Wubs

Departamento de Ecología Terrestre, Instituto Holandés de Ecología (NIOO-KNAW), PO Box 50, 6700 AB, Wageningen, Países Bajos

ER Jasper Wubs

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UEP diseñó, implementó y evaluó todos los experimentos, excepto el experimento de almacenamiento de fruta, donde KM asumió esta función. WR codiseñó e implementó las pruebas de campo (tratamientos de campo) y realizó pruebas a largo plazo (>15 años) de fungicidas de Alternaria. UEP y ERJW realizaron el análisis de datos y escribieron el manuscrito. Todos los autores proporcionaron comentarios constructivos sobre el manuscrito.

Correspondencia a Ulrich E. Prechsl.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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La versión original en línea de este artículo fue revisada: La versión original de este artículo contenía errores. Werner Rizzoli y Klaus Marschall fueron afiliados erróneamente al 'Terra Institute, Säbenertorgasse 2, 39042, Brixen, BZ, Italia', que es la afiliación actual de Ulrich E. Prechsl. Además, la dirección de correo electrónico de Ulrich E. Prechsl fue proporcionada incorrectamente como '[email protected]'; la dirección de correo electrónico correcta es '[email protected]'.

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Prechsl, UE, Rizzoli, W., Marschall, K. et al. El manejo sin fungicidas de la mancha foliar y la mancha del fruto por Alternaria en las manzanas indica que Alternaria spp. como colonizador secundario. Representante científico 13, 8431 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35448-2

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Recibido: 10 de enero de 2023

Aceptado: 18 de mayo de 2023

Publicado: 24 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35448-2

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