Los dispositivos de microingeniería permiten largos | Grupo de moldes médicos de Taiwán

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 5006 (2022) Citar este artículo

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La dinámica y la conectividad de los circuitos neuronales cambian continuamente en escalas de tiempo que van desde milisegundos hasta la vida de un animal. Por lo tanto, para comprender las redes biológicas, se requieren métodos mínimamente invasivos para registrarlas repetidamente en el comportamiento de los animales. Aquí describimos un conjunto de dispositivos que permiten grabaciones ópticas a largo plazo del cordón nervioso ventral (VNC) de Drosophila melanogaster adulto. Estos consisten en ventanas transparentes numeradas para reemplazar el exoesqueleto torácico, implantes flexibles para desplazar los órganos internos, un brazo de precisión para ayudar a la implantación y una plataforma con bisagras para atar moscas repetidamente. Para validar e ilustrar nuestro conjunto de herramientas, (i) mostramos un impacto mínimo en el comportamiento y la supervivencia de los animales, (ii) seguimos la degradación de las terminales nerviosas mecanosensoriales del órgano cordotonal durante semanas después de la amputación de la pierna, y (iii) descubrimos ondas de actividad neuronal por ingestión de cafeína. Por lo tanto, nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo abre la investigación de las adaptaciones de los circuitos motores y premotores en respuesta a lesiones, ingestión de drogas, envejecimiento, aprendizaje y enfermedades.

Los tejidos neuronales son notablemente plásticos y se adaptan a cambios en los estados internos y en respuesta a la exposición repetida a señales ambientales destacadas. En neurociencia, los estudios fisiológicos de fenómenos a largo plazo, incluida la formación de la memoria y la neurodegeneración, a menudo se han basado en la comparación de datos agrupados entre animales muestreados en múltiples momentos. Sin embargo, la cuantificación de las diferencias entre condiciones con este enfoque adolece de variabilidad interindividual. Por tanto, los registros longitudinales del mismo animal serían ideales para descubrir cambios adaptativos en la dinámica funcional y estructural de los circuitos neuronales. Es necesario superar importantes desafíos técnicos para realizar estudios a largo plazo en animales individuales, incluida la minimización de las agresiones experimentales.

Con la llegada de los registros neuronales basados en microscopía, en particular las imágenes de calcio de dos fotones, se ha hecho posible registrar crónicamente circuitos cerebrales in vivo de una manera mínimamente invasiva aprovechando dispositivos crónicos. Por ejemplo, las tecnologías de ventanas craneales se desarrollaron por primera vez para estudiar la neocorteza2 del ratón y desde entonces se han mejorado para adquirir campos de visión de imágenes más grandes3 y más profundos4, así como grabaciones de mayor duración5. Al igual que en los roedores, las imágenes cerebrales también se pueden realizar en la mosca adulta que se comporta bien, Drosophila melanogaster6,7, un organismo modelo popular que es (i) genéticamente manejable, (ii) tiene un sistema nervioso pequeño con muchas menos neuronas que los roedores, y ( iii) genera conductas sociales, de navegación y motoras complejas8,9,10,11.

Enfoques recientes han permitido registros crónicos a largo plazo de neuronas en el cerebro de la mosca12,13,14. De manera similar a la obtención de imágenes de la neocorteza de los roedores con una ventana craneal15, el cerebro de la mosca puede hacerse ópticamente accesible eliminando la cutícula de la cápsula de la cabeza y los tejidos subyacentes6. Para realizar imágenes repetidas o a largo plazo, este orificio se puede cubrir con pegamento curable por luz ultravioleta13, silicona de dos componentes16 o cubreobjetos cortado manualmente12. Sin embargo, las técnicas y tecnologías utilizadas para realizar imágenes a largo plazo en los cerebros de ratones y moscas no son adecuadas para registrar los circuitos motores en la médula espinal de los mamíferos o en el cordón nervioso ventral de los insectos. Al igual que la médula espinal, que está oscurecida por el hueso vertebral, el músculo y la lámina dorsal17, el acceso óptico al VNC requiere la extirpación de múltiples órganos y tejidos suprayacentes, incluidos los músculos de vuelo, los cuerpos grasos, el intestino y la tráquea. Las cirugías invasivas en la médula espinal permiten la implantación de una cámara18 o una pinza19. Sin embargo, el pequeño tamaño de la mosca limita el uso de dispositivos implantables convencionales, lo que representa un desafío importante para descubrir principios generales para el control motor a través de la investigación del VNC, experimentalmente manejable, un tejido nervioso que está organizado de manera tosca como la médula espinal de los mamíferos20, y cuyos principios de control se asemejan a los encontrados en los vertebrados21,22.

Recientemente desarrollamos un método de disección que brinda acceso óptico al VNC en animales atados y que se comportan mediante la eliminación quirúrgica y genética (en el caso de los músculos de vuelo indirecto) de los tejidos suprayacentes23. Sin embargo, esta técnica es invasiva y requiere la resección de los órganos torácicos y dejar abierta la cavidad torácica durante la obtención de imágenes. Esto excluye grabaciones que duren más de unas pocas horas. En consecuencia, ha sido imposible realizar mediciones repetidas de los circuitos premotores y motores en la misma mosca para arrojar luz sobre cómo estos circuitos se adaptan con el tiempo. Las herramientas existentes para imágenes cerebrales a largo plazo son insuficientes para imágenes VNC a largo plazo. A diferencia de las imágenes cerebrales, no se pueden pegar13 ni cortar manualmente cubreobjetos12 para cubrir el orificio torácico después de la disección. En cambio, se necesita un enfoque más preciso y reproducible que garantice que la hemolinfa no se escape del tórax. Además, para obtener acceso óptico al VNC se debe desplazar suave pero firmemente los grandes órganos y tejidos torácicos suprayacentes sin alterar su función.

Aquí, describimos un conjunto de dispositivos de microingeniería que abordan todos estos desafíos para permitir grabaciones repetidas y a largo plazo del VNC de Drosophila durante más de un mes. Estos dispositivos abordan los desafíos únicos asociados con el estudio de organismos modelo pequeños (la mosca mide entre 2 y 3 mm de largo) que requieren una manipulación extremadamente suave. Específicamente, diseñamos (i) un manipulador ("brazo") que nos permite movernos hacia un lado y mantener temporalmente en su lugar los órganos torácicos, (ii) implantes flexibles que eliminan la necesidad de extirpar quirúrgicamente los órganos torácicos para obtener acceso óptico al VNC, (iii) una ventana de polímero transparente que encierra la cavidad torácica y está numerada para permitir que las moscas individuales se distingan entre sí a lo largo de las sesiones de imágenes, y (iv) una etapa de remontaje para atar moscas de manera suave pero firme para grabaciones repetidas. Proporcionamos descripciones detalladas de cómo fabricar y utilizar todas estas herramientas para facilitar su replicación y adopción por parte de otros laboratorios.

Demostramos que los implantes y las ventanas tienen un impacto mínimo en la supervivencia y la locomoción de los animales, y que permiten registros neuronales durante al menos un mes. Luego ilustramos casos de uso de nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo en dos estudios de prueba de concepto. Primero, medimos longitudinalmente la degradación de la inervación de las neuronas mecanosensoriales de las extremidades del VNC durante las dos semanas posteriores a la extracción de las piernas. En segundo lugar, ilustramos cómo (al dejar intactos los órganos torácicos) se puede medir el impacto de la ingestión de drogas en la dinámica de la población neuronal. Por lo tanto, nuestro conjunto de herramientas de imágenes torácicas a largo plazo permite el estudio longitudinal repetido de la dinámica neuronal estructural y funcional en circuitos motores y premotores. En general, estas herramientas también se pueden utilizar para estudiar otros tejidos torácicos, incluidos los músculos de vuelo indirecto, el intestino y la tráquea.

Desarrollamos dispositivos de microingeniería y protocolos de micromanipulación asociados que permiten el acceso óptico al VNC de la mosca durante más de un mes. Las moscas implantadas no presentan déficits evidentes en su capacidad para alimentarse, caminar, poner huevos o interactuar con otros. (Fig. 1a y Película complementaria 1). El acceso óptico depende de dos componentes principales: un implante transparente y flexible (Fig. 1b) y una ventana torácica transparente (Fig. 1c). La fabricación de las ventanas debe ser reproducible y deben ser lo suficientemente grandes como para sellar de forma segura la abertura torácica y evitar la fuga de hemolinfa. Las soluciones desarrolladas para obtener imágenes cerebrales a largo plazo, como el sellado con pegamento curable por luz ultravioleta13 o un trozo de cubreobjetos cortado manualmente12, no abordan estos desafíos. Diseñamos y microfabricamos una ventana personalizada utilizando un polímero biocompatible, SU-8, mediante fotolitografía (Figura complementaria 1). Dado que los implantes no son necesarios para obtener imágenes cerebrales a largo plazo, estos tuvieron que diseñarse de novo y sin inspiración de enfoques anteriores. Nuestros primeros implantes eran estructuras rígidas destinadas a proteger las regiones de interés (ROI) de imágenes de VNC de la oclusión por parte de los tejidos torácicos (Figura complementaria 2, 'iteraciones 1 y 2'). Las iteraciones posteriores intentaron combinar ventanas torácicas con pilares protectores (Figura complementaria 2, 'iteraciones 3 y 4'). Sin embargo, ambos prototipos iniciales produjeron tasas de supervivencia prohibitivamente bajas. Logramos un gran avance al adoptar un enfoque completamente diferente: diseñamos implantes en forma de V comprimibles mecánicamente y dóciles (a base de polímeros). A través de varias iteraciones y pruebas, convergimos en el tamaño y ángulo específicos de estos implantes, lo que resultó en una tasa de supervivencia postimplantación muy alta. Fabricamos estos implantes en masa utilizando litografía suave, una técnica que se basa en la creación rápida de prototipos y el moldeado de réplicas (Figuras complementarias 3 y 4).

a Las moscas adultas implantadas pueden criarse en entornos complejos. Un animal implantado (ver ventana torácica dorsal (flecha negra)) interactúa con un animal no implantado. La barra de escala es de 0,5 mm. b Un implante transparente, mecánicamente compatible, microfabricado a partir de Ostemer 220. La barra de escala es de 50 μm. c Una ventana torácica transparente y numerada microfabricada a partir de SU-8. La barra de escala es de 50 μm. d Para la implantación, se monta un animal, primero el tórax, en un orificio en una cuña de acero dentro de una etapa de disección. e Una disección de varios pasos permite el acceso óptico a largo plazo al cordón nervioso ventral (VNC). izquierda Se corta un agujero en la cutícula torácica dorsal, que revela el proventrículo (amarillo), la tráquea (cian) y la glándula salival (magenta) que recubren el cordón nervioso ventral (VNC, azul oscuro). Los músculos de vuelo indirecto (IFM) fueron degradados por la expresión tisular específica de Reaper (Act88F:Rpr)23. Luego, utilizando un brazo manipulador diseñado a medida, se desplazan los órganos torácicos, revelando el VNC. medio A continuación, se coloca el implante dentro de este orificio torácico en una configuración estrecha y cerrada mecánicamente. derecha Se retira el brazo y se libera el implante, lo que hace que se abra y empuje mecánicamente los órganos que cubren el VNC. Finalmente, se sella una ventana transparente para encerrar el agujero torácico. f Una etapa de remontaje nanoimpresa en 3D permite montar y desmontar animales para obtener imágenes repetidas de dos fotones. izquierda El mecanismo monolítico se acciona alrededor de una bisagra flexible. derecha Imagen de muestra de un animal atado a la plataforma de remontaje, visto desde arriba. g Los animales implantados atados a la etapa de remontaje se colocan bajo un microscopio de dos fotones rodeado por un conjunto de cámaras. Esta configuración permite registros simultáneos de la actividad neuronal y el comportamiento animal. El recuadro muestra una imagen de cámara superpuesta con poses 2D basadas en aprendizaje profundo estimadas con DeepFly3D25. h (fila superior) El tórax dorsal de un animal implantado, visto desde el microscopio de disección, y (fila inferior) su VNC, visualizado mediante microscopía de dos fotones. Este animal expresa GFP en todo el sistema nervioso y se registra a 3 ppp izquierdo, 14 ppp medio y 28 ppp derecho. Las pilas Z están codificadas por colores de profundidad (100 μm). La barra de escala es de 25 μm.

Para utilizar estas herramientas, desarrollamos un protocolo de manipulación ilustrado en la Película complementaria 2. Brevemente, primero montamos animales en una etapa de disección quirúrgica usando pegamento curable con UV (Fig. 1d) 23. A continuación, cortamos un orificio de forma cuadrada en la cutícula dorsal con una aguja de jeringa de 30 G (Fig. 1e - panel izquierdo). Posteriormente se eliminan los músculos de vuelo indirecto (IFM) para crear una abertura torácica para el implante. Para minimizar el impacto de la microcirugía, trabajamos con animales que expresan la proteína inductora de apoptosis, Reaper, específicamente en IFM (Act88F:Rpr). La expresión de Reaper produce una rápida degradación del tejido muscular23, el resto del cual se puede eliminar fácilmente con la aguja de la jeringa. Sin embargo, esta línea genética no es estrictamente necesaria para hacer uso de estas herramientas. Una vez expuestos los tejidos torácicos, utilizamos una fina aguja de vidrio y unas pinzas para separar unilateralmente las fibras traqueales que conectan el intestino y la glándula salival izquierda. Diseñamos un brazo de manipulación personalizado (Fig. 5 complementaria) para empujar los órganos internos (intestino, glándula salival y tráquea) hacia el lado derecho de la cavidad torácica (Fig. 1e - panel izquierdo). Esto permite insertar el implante en un estado cerrado en la cavidad torácica recién accesible (Fig. 1e - panel central y Fig. complementaria 4). Al soltarse, el implante se abre gradualmente manteniendo los órganos contra la pared torácica después de que se retrae el brazo de manipulación (Fig. 1e - panel derecho). Sellamos la cavidad torácica expuesta pegando una ventana de polímero transparente a la cutícula (Fig. 1e - panel derecho). Estas ventanas tienen números únicos grabados en sus superficies que permiten identificar y distinguir entre animales implantados. Luego podemos separar los animales quitando el pegamento curable con UV que sujeta el escutelo a la etapa de disección, permitiéndoles comportarse libremente.

Para facilitar la atadura suave y repetida de moscas implantadas, imprimimos una etapa de remontaje (Fig. 1f y Fig. Suplementaria 6) utilizando polimerización de dos fotones24. Este proceso de fabricación tiene la precisión necesaria para fabricar elementos 3D que mantengan a los animales en su lugar de manera confiable. Cuando estaban montados, estudiamos animales utilizando un sistema de microscopio de dos fotones rodeado por una matriz de múltiples cámaras. Este sistema permite grabaciones simultáneas de la actividad neuronal en el VNC23, así como el seguimiento de partes del cuerpo en 3D sin marcadores25 (Fig. 1g). En la gran mayoría de los casos nuestro protocolo de implantación fue exitoso. Con poca frecuencia, los animales implantados exhibieron movimientos específicos de los tejidos respiratorios o digestivos que podrían ocluir el VNC durante la obtención de imágenes (Figura complementaria 7). La implantación exitosa permitió el acceso óptico al VNC que permaneció prácticamente sin cambios durante un mes. Esto permitió estudios repetidos de la estructura (Fig. 1h y Película complementaria 3) y la dinámica funcional de las poblaciones neuronales en moscas hembra (Película complementaria 4) y macho (Película complementaria 5). Nuestras herramientas de registro a largo plazo también podrían aplicarse al registro de pares de neuronas genéticamente identificables. Ilustramos esto al obtener imágenes de la actividad de un par de neuronas descendentes DNa01 durante tres días (1, 3 y 5 días después de la implantación (dpi)). Esta actividad se correlaciona con el giro locomotor23 (Figura complementaria 8 y Película complementaria 6). Aunque aquí nos centramos en obtener acceso óptico al neurómero conectivo cervical y protorácico (T1) del VNC (Fig. 1h), nuestro enfoque es general y permite el rediseño y la microfabricación de implantes que permiten la obtención de imágenes de otras regiones del VNC. Como prueba de concepto, modificamos un implante, lo que permitió restringir el tejido en la parte posterior del tórax y obtener acceso óptico a los neurómeros T2 y T3 (Figura complementaria 9).

Para validar nuestro enfoque de registro a largo plazo, primero estudiamos el impacto potencial de la implantación en la esperanza de vida. Específicamente, medimos la longevidad de tres grupos de animales (n = 40 por grupo): (i) moscas que no fueron manipuladas ("intactas"), (ii) animales que soportaron anestesia fría, se montaron en la etapa de disección y ala. eliminación ("Implantado simulado"), o (iii) moscas que se sometieron al procedimiento de implantación completo ("Implantado"). Para este experimento, el 73% de los animales implantados sobrevivieron más de 4 h después de la cirugía. Debido a que el procedimiento quirúrgico y de implantación para una sola mosca dura aproximadamente 40 minutos de principio a fin, el rendimiento total (una combinación de este tiempo de implantación y la tasa de supervivencia aguda) fue de un animal implantado cada 55 minutos. Entre las moscas que sobrevivieron más de 4 h después de la implantación, observamos una supervivencia máxima de hasta 88 días. Sin embargo, las moscas implantadas mostraron una mayor mortalidad que los animales intactos en los primeros días después de la implantación (Fig. 2a). En particular, las moscas implantadas de forma simulada habían aumentado de manera similar la mortalidad en los primeros días, lo que sugiere que el manejo de los animales antes de la implantación, y no la implantación en sí, fue responsable del aumento de la mortalidad. Obtuvimos tasas de supervivencia similares para moscas macho implantadas versus intactas examinadas durante 20 días (Figura complementaria 10a).

a Curvas de supervivencia para animales hermanos genéticamente idénticos que (i) no fueron manipulados experimentalmente (verde, "Intacto"), (ii) atados, anestesiados con frío y a quienes se les quitaron las alas (azul, "Implantado simulado"), o (iii ) preparado para imágenes a largo plazo mediante implantación y adición de una ventana torácica (naranja, "implantada"). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b Los comportamientos se compararon analizando la dinámica de caminar hacia atrás activado optogenéticamente dentro de una arena de forma cuadrada y redondeada. La locomoción se analizó y trazó computacionalmente, mostrando la trayectoria inicial hacia adelante del animal (cian) y la posterior trayectoria hacia atrás evocada ópticamente (púrpura). c Velocidades de traslación de animales intactos (arriba), implantados simulados (medio) e implantados (abajo) durante 30 s de comportamiento espontáneo, seguidos de tres períodos de estimulación optogenética de 3 s cada uno (rosa, "Stim"). Aquí, agrupamos los datos registrados en tres períodos de tiempo durante un mes. Se muestran trazas crudas (grises) y medias (azules). A partir de estas series de tiempo, cada evento de estimulación es un punto de datos a partir del cual calculamos estadísticas resumidas (grupo intacto, n = 286 eventos; grupo implantado simulado, n = 208 eventos; grupo implantado, n = 213 eventos), incluido (d) el pendiente negativa inicial en la velocidad de traslación --- caminata hacia atrás --- tras la estimulación optogenética, (e) la distancia de caminata hacia atrás recorrida durante todo el período de estimulación optogenética, y (f) la velocidad de traslación negativa máxima durante todo el período de estimulación optogenética. Un asterisco (*) indica P <0,05. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, aunque la implantación no afectó dramáticamente la longevidad, razonamos que colocar un objeto microfabricado dentro del tórax podría afectar negativamente la marcha, posiblemente debido a la perturbación de la musculatura relacionada con las piernas, o simplemente a la carga adicional. Investigar esta posibilidad es difícil porque las moscas utilizan una variedad de modos de andar diferentes a diferentes velocidades y maniobras al caminar26. Por lo tanto, para poder realizar un análisis cuantitativo de la marcha, impulsamos la marcha estereotipada hacia atrás mediante la activación optogenética del canal catiónico activado por luz, CsChrimson27 expresado en neuronas descendentes Moonwalker (MDN)28,29. Estimulamos a los animales en una arena hecha a medida (Fig. 2b) repetidamente durante el transcurso de un mes. Esto nos permitió cuantificar y comparar las trayectorias de marcha de moscas intactas, implantadas o implantadas. Primero registramos comportamientos espontáneos durante 30 s y luego entregamos tres destellos consecutivos de luz naranja de 590 nm durante 3 s cada uno (Fig. 2c, rosa y Fig. complementaria 11a) con un intervalo entre estímulos de 10 s. Estos experimentos se realizaron en los mismos animales en tres períodos de tiempo durante un mes (1 a 3 días después de la implantación (dpi), 14 a 16 ppp y 28 a 30 ppp). Tras la estimulación optogenética, observamos que los animales generaban una marcha rápida hacia atrás que gradualmente disminuía y regresaba rápidamente a la línea de base cuando se apagaba la luz (Película complementaria 7). En todas las sesiones de grabación, observamos una pequeña diferencia significativa en la aceleración inicial hacia atrás (Fig. 2d) entre el grupo intacto y el grupo con implante simulado (P = 0,044 Kruskal-Wallis con prueba de Conover post-hoc) y entre el grupo "intacto". y el grupo "implantado" (P = 0,044). Sin embargo, no se observaron diferencias estadísticas en las velocidades de traslación de los animales intactos, implantados simulados e implantados en términos de la distancia total recorrida hacia atrás (Fig. 2e) y la velocidad máxima de marcha atrás (Fig. 2f). Se obtuvieron resultados similares al comparar cohortes con restricción de edad. Específicamente, no observamos una diferencia entre los grupos intactos e implantados en la aceleración inicial hacia atrás para cualquier cohorte de edad (1 a 3 ppp, 14 a 16 ppp o 28 a 30 ppp). Las moscas intactas tenían una aceleración hacia atrás ligeramente más lenta (esto puede deberse al contacto entre las patas y las alas que estaban caídas en los animales que expresaban Act88F:Rpr). Notamos una diferencia significativa entre ambos grupos de control a 14-16 ppp (Fig. 11b, c complementaria) para (i) la pendiente de respuesta de caminar hacia atrás (P = 0,009), (ii) la distancia recorrida al caminar hacia atrás (P = 0,0008 ), y (iii) la velocidad de traslación negativa máxima (P = 0,003). La marcha espontánea tampoco se modificó cualitativamente en moscas macho implantadas versus moscas intactas (Película complementaria 8). En conjunto, estos resultados sugieren que la locomoción no se ve significativamente afectada por la implantación.

Los circuitos neuronales conservan una capacidad de reordenamiento estructural durante toda la edad adulta30,31. Esto permite adaptaciones en respuesta a lesiones del sistema nervioso32,33,34 y accidentes cerebrovasculares35. De manera similar, en las moscas, la marcha locomotriz se reorganiza después de la amputación de una pierna36. Sin embargo, el impacto de la amputación en los circuitos de control de las extremidades sigue sin explorarse porque descubrir estos cambios requiere obtener imágenes del VNC de los animales amputados a lo largo de días o semanas. Aunque, en principio, se podrían agrupar datos de varios animales en días específicos después de la amputación de la pierna, esto tiene dos deficiencias importantes. En primer lugar, la variabilidad entre animales limitaría la capacidad de resolver la degeneración de estructuras neuronales específicas. En segundo lugar, este enfoque consumiría más tiempo y requeriría muchos más experimentos y animales por punto temporal de interés. Por el contrario, las imágenes longitudinales son ideales para descubrir cambios dinámicos en estructuras neuronales utilizando relativamente pocos animales. Para ilustrar esta posibilidad, seguimos la degradación de las aferencias mecanosensoriales propioceptivas primarias en el VNC después de la amputación de la pierna. Específicamente, visualizamos las terminales de los axones de los órganos cordotonales femorales propioceptivos de la pierna amputada (Act88F-Rpr/+; iav-Gal4/UAS-GFP; +/+) en el neurómero T1 del VNC. Las moscas se implantaron el primer día posterior a la eclosión (dpe). Luego, un día después de la implantación (1 ppp), realizamos imágenes volumétricas de dos fotones de T1. Los volúmenes constaban de 100 imágenes tomadas a intervalos de 1 μm de profundidad. Luego, a 2 ppp, se amputó la pata delantera izquierda de cada animal experimental cerca de la articulación tórax-coxa (Fig. 3a).

a En animales de experimentación, la pata delantera izquierda fue amputada en la articulación tórax-coxa a 2 ppp. b Esquema del sistema nervioso de la mosca. La región VNC fotografiada está resaltada (gris). Proyección z de desviación estándar de volúmenes de imágenes confocales registrados de moscas que (c) se dejaron intactas o (d) se amputaron a 2 ppp (neurópilo teñido con nc82 delineado en gris; fluorescencia de GFP en negro). Los tejidos se tomaron de animales implantados cuyas patas delanteras izquierdas fueron amputadas. El tejido VNC se eliminó y se tiñó a 20 ppp. La punta de flecha negra indica la región VNC que muestra la mayor diferencia entre la inervación del propioceptor intacto y amputado. La barra de escala es de 50 μm. Proyecciones de intensidad máxima de pilas z registradas de (e) un animal intacto (control) o (f) amputado. Los datos se adquirieron mediante microscopía de dos fotones. Se muestran imágenes tomadas a 1, 2, 4 y 15 ppp. Las imágenes se registran en la imagen de 1 ppp. La barra de escala es de 50 μm. Las puntas de flecha blancas indican terminales de axón en degradación en el VNC de animales amputados. g, h Fluorescencia medida a lo largo de días utilizando microscopía de dos fotones de animales intactos (n = 5; triángulos azules) o amputados (n = 5; círculos de color rojo anaranjado). Las mediciones indican fluorescencia media dentro de la región de interés (ROI) (g) cian o (h) púrpura como en los paneles e y f, normalizada y dividida por la fluorescencia media a 1 ppp. Los diagramas de caja indican la mediana, el primer y el tercer cuartil. Comparaciones estadísticas realizadas con una prueba U de Mann-Whitney (bilateral) para la cual un asterisco (*) indica P <0,05 y dos asteriscos (**) indican P <0,01. Para el panel g, P = 0,006 (día 4); 0,006 (día 5); 0,009 (día 6); 0,006 (día 7); 0,018 (día 8); 0,009 (día 9); 0,006 (día 10); 0,006 (día 11); 0,009 (día 12); 0,006 (día 13); 0,006 (día 14); 0,006 (día 15). Para el panel h, P = 0,03 (día 4); 0,006 (día 5); 0,009 (día 6); 0,006 (día 7); 0,009 (día 8); 0,009 (día 9); 0,006 (día 10); 0,006 (día 11); 0,009 (día 12); 0,006 (día 13); 0,006 (día 14); 0,006 (día 15). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las moscas implantadas toleraron la amputación de patas y generaron comportamientos normales con las cinco patas restantes (como en la referencia 36). Todos los días durante 15 días, recopilamos volúmenes de imágenes T1 (Fig. 3b) de animales de control ("Intactos") y de animales a los que se les quitaron las patas delanteras izquierdas ("Amputados"). Realizamos disección, tinción e imágenes confocales de VNC 18 días después de la extracción de la pierna para confirmar que la inervación mecanosensorial del neurómero T1 de VNC persistió en animales intactos (Fig. 3c) pero se degradó en animales amputados (Fig. 3d). Un examen minucioso de los volúmenes de imágenes del microscopio de dos fotones reveló que, en los animales de control, se produjo algo de fotoblanqueo en la región de la imagen durante días (Fig. 3e). Sin embargo, esta disminución de la fluorescencia no fue tan profunda como la reducción de la señal observada en las terminales axónicas del órgano cordotonal del neuropilo T1 izquierdo de animales amputados (Fig. 3f; Fig. 12 complementaria y Película complementaria 9). Al cuantificar los cambios en la intensidad de la señal dentro de regiones de interés (ROI) específicas de las inervaciones de los axones cordotonales dentro del VNC 37, medimos una reducción de fluorescencia significativa y altamente reproducible en animales amputados versus intactos (Prueba U de Mann-Whitney, * indica P <0,05 y ** indica P <0,01) (Fig. 3g, h).

Además de ser morfológicamente adaptables a lo largo de días y semanas, los circuitos neuronales también modulan continuamente su dinámica en escalas de tiempo más cortas dependiendo del estado interno de un animal. En Drosophila, como en los vertebrados, estos estados incluyen hambre38, fatiga39, excitación sexual40, agresión41 y excitación defensiva42. Los estados internos también pueden cambiar tras la ingestión de sustancias psicoactivas, incluida la cafeína43,44,45. La monitorización continua del sistema nervioso es crucial para descubrir cómo los circuitos se reconfiguran durante estos estados cambiantes.

Nuestra técnica anterior para estudiar la dinámica neuronal de VNC en animales que se comportan23 requería la eliminación de grandes secciones de intestino, lo que reducía la longevidad de los animales y hacía imposibles las grabaciones a largo plazo que capturaran los cambios en los estados internos. Además, aunque las respuestas gustativas se pueden estudiar en el cerebro46, la extirpación del intestino impide la alimentación y, en consecuencia, no permite investigar cómo la saciedad o la ingestión de sustancias psicoactivas modulan la dinámica neuronal en el VNC. Nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo preserva el intestino, lo que permite alimentar a los animales durante la microscopía de dos fotones. Por lo tanto, a continuación nos preguntamos hasta qué punto nuestras tecnologías podrían usarse para descubrir el impacto de la ingestión de drogas en la dinámica neuronal.

Las moscas expuestas a dosis bajas de cafeína reducen el sueño43,44 y aumentan la actividad locomotora45. Aquí, preguntamos hasta qué punto la ingesta de cafeína también podría impulsar cambios globales en la dinámica de la población neuronal. Para probar esto, primero matamos de hambre a los animales durante 21 a 23 h para fomentar la alimentación. Luego, después de la implantación, registramos la actividad neuronal en el conectivo cervical ("Antes de alimentar"). Mientras continuaban registrando la actividad neuronal, los animales fueron alimentados (Fig. 4a) con una solución de control ("solo sacarosa") que contenía 8 mg/ml de sacarosa y 1 mg de colorante de amaranto (para confirmar la alimentación47) (Película complementaria 10), o un solución experimental que también contenía 8 mg/ml o 40 mg/ml de cafeína: "Cafeína baja" (Película complementaria 11) o "Cafeína alta" (Película complementaria 12), respectivamente. Continuamos registrando la actividad neuronal y el comportamiento durante los siguientes 38 minutos. La alimentación se confirmó mediante una evaluación post hoc de la coloración abdominal por la ingestión de tinte (Fig. 4b). Durante las imágenes, examinamos la actividad de las neuronas ascendentes y descendentes cuyos axones pasan a través del conectivo cervical que une el cerebro y el VNC. Para hacer esto, realizamos imágenes de dos fotones de sección transversal coronal del conectivo cervical torácico (Fig. 4c) 23 en moscas que expresan el indicador de calcio codificado genéticamente, GCaMP6f, así como el marcador anatómico, tdTomato, en todo el sistema nervioso ( Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-opGCaMP6f; UAS-tdTomato/+). Para superar la deformación y traducción de la imagen que ocurre durante los comportamientos animales, registramos datos de imágenes utilizando un algoritmo basado en flujo óptico (ver Métodos)23. Después del registro de la imagen, nuestros datos de imágenes coronales revelan la actividad de los axones que pertenecen a las neuronas descendentes que impulsan acciones48,49 y a las neuronas ascendentes que transmiten estados de comportamiento en curso al cerebro50. Estos axones son evidentes como elipses en nuestras imágenes de microscopía de dos fotones (Fig. 4d, puntas de flecha blancas). Estas regiones de interés panneuronales (ROI) son consistentes con las que observamos al obtener imágenes de la actividad neuronal en conjuntos muy dispersos de neuronas descendentes23 y ascendentes50. Esto es más evidente para el par de grandes axones de neuronas descendentes de fibras gigantes51 que pasan a través de la línea media dorsal del conectivo cervical (Fig. 4d, asteriscos blancos).

a Representación digital de una mosca alimentada mientras se registran las neuronas utilizando un microscopio de dos fotones. b Foto de un animal implantado después de ingerir una solución de cafeína de alta concentración durante una microscopía de dos fotones. La punta de flecha blanca indica una coloración púrpura del abdomen, lo que confirma la digestión de una solución de cafeína y sacarosa mezclada con tinte de amaranto. c Esquema del cordón nervioso ventral que indica la región de imagen en el conectivo del cuello. d Actividad neuronal media codificada por colores durante todos los períodos no locomotores de una mosca antes de alimentarse (los mismos datos que el panel superior en f), incluidas las anotaciones de los axones individuales que pasan a través del conectivo del cuello (puntas de flecha). Los asteriscos indican la ubicación de los axones de fibras gigantes. e Fluorescencia normalizada en todos los axones que pasan a través del conectivo del cuello torácico durante grabaciones de 4 minutos, ya sea antes (azul), durante (verde), poco después (naranja) o mucho después (rojo) de la alimentación. Las moscas fueron alimentadas con una solución que contenía solo sacarosa (izquierda), sacarosa y una dosis baja (en el medio) o una dosis alta de cafeína (derecha). f Actividad neuronal media codificada por colores durante todos los períodos no locomotores de una mosca, ya sea antes (arriba), inmediatamente después (medio) o mucho después (abajo) de la ingestión de una solución de cafeína de alta concentración. g Análisis estadístico que indica la presencia de ondas de actividad. La actividad neuronal se normaliza utilizando parámetros calculados sobre la actividad previa a la alimentación (Métodos). La actividad normalizada máxima se muestra para tres moscas por condición antes, durante y después de la alimentación. La actividad máxima solo aumenta significativamente > 29 minutos después de la alimentación con una solución de cafeína de alta concentración (pruebas U de Mann-Whitney unilaterales, * indica P <0,05, P = 0,04 para ambos * informados, ns indica no significativo). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. h El conectivo cervical en un animal implantado se segmenta en cuatro regiones de interés (ROI). Estos se superponen sobre una imagen de proyección de tiempo con desviación estándar. i Actividad neuronal normalizada hasta un pico de fluorescencia durante una ola de actividad. Las trazas están codificadas por colores como en el panel h. El pico de fluorescencia media en todas las regiones se centra en 0 s. j Hora de máxima actividad en píxeles. El pico de actividad media en todo el conectivo del cuello se estableció en 0 s.

En las tres condiciones experimentales, antes, durante y poco después de la alimentación, observamos fluctuaciones en la actividad neuronal que se asociaron con épocas de caminata (Fig. 4e, trazos azules, verdes y naranjas; Fig. Suplementaria 13c, Mosca 7 y Suplementaria). Películas 10-12). Sin embargo, más de 29 minutos después de la alimentación, observamos grandes oleadas de actividad únicamente en moscas alimentadas con la solución de cafeína de alta concentración (Fig. 4e, trazos rojos). Las ondas tenían una amplitud mucho mayor que las fluctuaciones de la actividad neuronal asociadas con la locomoción espontánea. Las ondas de actividad se extendieron por todo el conectivo (Fig. 4f) y se asociaron con una postura rígida general acompañada de micromovimientos (Película complementaria 13). Para cuantificar la presencia y amplitud de ondas en diferentes momentos y entre condiciones experimentales, normalizamos la actividad neuronal a través del conectivo cervical en relación con la observada antes de alimentarse para cada mosca. Luego calculamos la fluorescencia máxima normalizada (límite superior del percentil 99%) para los períodos antes, durante y después de la alimentación. Hasta aproximadamente 29 minutos después de la alimentación, el nivel máximo de actividad de las moscas alimentadas con una alta concentración de cafeína no fue significativamente diferente de las moscas alimentadas con sacarosa o una solución baja en cafeína (pruebas U de Mann-Whitney, P > 0,05). Por el contrario, entre 29 y 38 minutos después de la alimentación, la actividad máxima de cada mosca alimentada con una solución con alto contenido de cafeína fue significativamente mayor que en las otras condiciones (pruebas U de Mann-Whitney, P = 0,040), debido a la onda de actividad neuronal (Fig. .4g). La evolución temporal de estas ondas también fue reproducible: la actividad comenzó en el conectivo dorsalmedial (azul), luego dorsolateral (verde) y luego ventral (naranja). Las neuronas de fibra gigante (rojas) 51 fueron las últimas en activarse y mantuvieron una actividad alta durante períodos de tiempo más largos (Fig. 4h – j y Fig. complementaria 13d – i). Estos datos ilustran que nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo se puede utilizar para investigar cómo la ingestión de alimentos o drogas influye en los estados internos y la dinámica neuronal global.

Aquí hemos descrito dispositivos de microingeniería que abren la investigación integral y longitudinal del control motor en el comportamiento de los animales. Específicamente, permitimos grabaciones de dos fotones a largo plazo de tejidos en el tórax adulto de Drosophila, incluidos circuitos premotores, sensoriales y motores que se dirigen y residen dentro del VNC. Nuestro conjunto de herramientas está diseñado para abordar los desafíos únicos del registro a largo plazo del VNC en comparación con enfoques más simples que permiten registros longitudinales de neuronas en el cerebro12,13: consta de (i) un brazo micromanipulador, (ii) un polímero- implante blando a base para desplazar órganos torácicos, (iii) una ventana de polímero transparente numerada que se puede fabricar de manera reproducible para sellar la abertura torácica, y (iv) una etapa de sujeción compatible que permite un montaje suave y repetido alrededor del tórax de los animales. para imágenes de dos fotones. Juntas, estas herramientas amplían la ventana de tiempo de registro neuronal de sólo unas pocas horas23 a más de un mes, sin reducir notablemente la vida útil de los animales implantados ni perturbar significativamente su comportamiento locomotor. Hemos ilustrado varios casos de uso para nuestro enfoque de imágenes a largo plazo, que incluyen (i) grabaciones de semanas de duración de morfología neuronal, actividad panneuronal y actividad neuronal escasa, (ii) degradación de semanas de proyecciones de neuronas sensoriales de extremidades al VNC de una extremidad amputada, y (iii) cambios globales en la actividad neuronal después de la ingestión de drogas.

Nuestros experimentos de longevidad confirmaron que la esperanza de vida de las moscas implantadas era similar a la de los animales intactos. Sin embargo, las curvas de supervivencia se desplazaron para las moscas implantadas y las implantadas simuladas debido al exceso de mortalidad dentro de los primeros días después de la cirugía. Esto sugiere que esas pérdidas iniciales podrían deberse al manejo quirúrgico y no estar específicamente relacionadas con la implantación. De acuerdo con esto, nuestros estudios sobre la marcha hacia atrás no revelaron cambios claros en las métricas locomotoras entre los animales de control y los implantados. Sin embargo, en el futuro, sería importante confirmar el impacto mínimo de la implantación en comportamientos más complejos como el cortejo y el cruce de brechas.

En un primer estudio de caso de nuestro conjunto de herramientas, investigamos la degradación anatómica de las proyecciones cordotonales al VNC durante dos semanas después de la amputación de la pierna. Allí observamos una marcada degradación de las terminales de las neuronas mecanosensoriales en la primera semana después de la amputación. La evolución temporal de esta degradación fue heterogénea entre las regiones de interés, lo que es consistente con la existencia de distintas poblaciones de células cordotonales 37 que pueden tener diferentes niveles de resistencia a la degradación. Alternativamente, algunas terminales pueden surgir a través de proyecciones ascendentes desde T2 (pierna media) o T3 (pata trasera) y, por lo tanto, no se ven directamente afectadas por la amputación de la pata delantera. Drosophila se ha utilizado previamente en numerosos estudios como modelo de lesión nerviosa52, donde se ha demostrado que la degradación axonal después de una lesión puede ser similar a la degeneración walleriana en mamíferos53. Por lo tanto, nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo podría usarse en el futuro para probar intervenciones farmacológicas que puedan ralentizar o prevenir la degeneración axonal inducida por lesiones en los circuitos motores.

Al analizar la actividad de las neuronas descendentes y ascendentes en el conectivo cervical torácico después de la ingestión de cafeína, no observamos grandes cambios en la actividad neuronal en la condición de baja concentración de cafeína, a pesar de los cambios de comportamiento informados previamente45. Por otro lado, observamos grandes ondas de actividad neuronal después de la ingestión de una solución de cafeína con alta concentración. Algunas moscas tenían varias de estas ondas, lo que sugiere que no se deben a la liberación de calcio a partir de un proceso de muerte celular terminal. Sin embargo, el origen de esta dinámica del calcio aún no está claro. Por ejemplo, se ha demostrado que la cafeína induce la liberación citoplásmica de reservas internas de Ca2+54. Aunque esto puede ser poco probable en el caso de la ingestión de cafeína, aún no está claro si las ondas de actividad que se propagan temporalmente son el resultado de tal mecanismo o de una activación neuronal profunda y podría ser el foco de futuros estudios que utilicen estas herramientas. En particular, observamos que los animales no se recuperaron después de alimentarse con nuestra solución de cafeína de alta concentración. Sin embargo, esta prueba de concepto ilustra cómo las imágenes a largo plazo en Drosophila pueden usarse en el futuro para detectar el impacto de la ingestión de drogas en la dinámica neuronal en el comportamiento de los animales.

Con base en estos estudios de casos exitosos, imaginamos que nuestros dispositivos de imágenes a largo plazo con microingeniería se pueden aprovechar para estudiar una variedad de preguntas y desafíos adicionales. Por ejemplo, se podrían aplicar estos dispositivos para registrar la progresión de la muerte celular en modelos de Drosophila de trastornos neuronales como la enfermedad de Parkinson55. Nuestro proceso de fabricación de implantes también es generalizable. Por lo tanto, las formas de los implantes podrían adaptarse para abordar otros desafíos experimentales, incluido el objetivo de los circuitos de los ganglios abdominales que regulan la receptividad de apareamiento en las hembras56. Además, los implantes podrían modificarse para almacenar y liberar componentes activos que, por ejemplo, administren compuestos a la hemolinfa de forma controlada. Finalmente, se podrían tomar medidas adicionales para automatizar la implantación, por ejemplo, abriendo la cutícula torácica usando un láser excimer UV57, o desarrollando técnicas de manipulación robótica para desplazar automáticamente los órganos torácicos, posicionar el implante y sellar el orificio torácico con una ventana58.

En resumen, los desarrollos tecnológicos presentados en este trabajo permiten una variedad de experimentos en moscas individuales en una amplia gama de escalas de tiempo, abriendo una comprensión de cómo los sistemas biológicos (en particular los circuitos premotores y motores) cambian durante el envejecimiento o la progresión de la enfermedad, siguiendo lesión, aprendizaje o experiencias sociales, en respuesta a cambios en el estado interno, o como consecuencia de la ingestión de alimentos o drogas. Estos datos, a su vez, pueden inspirar el desarrollo de controladores más adaptativos para sistemas artificiales que tengan la capacidad de cambiar de forma y función para adaptarse a capacidades y necesidades en continuo cambio.

Se fabricaron ventanas torácicas (discos de polímero transparentes) mediante fotolitografía59. Todos los pasos de exposición se realizaron en un alineador de máscara (MJB4, Süss MicroTec, Alemania) utilizando iluminación i-line. Las máscaras cromadas se fabricaron utilizando un grabador láser directo (VPG-200, Heidelberg Instruments, Alemania) y un procesador de máscaras automático (HMR900, HamaTech, Alemania). Las dimensiones de las estructuras microfabricadas se midieron utilizando un microscopio óptico (DM8000 M, Leica Microsystems, Suiza) o un perfilador de superficies mecánico (Dektak XT, Bruker Corporation, EE. UU.). El protocolo comenzó tratando la superficie de una oblea de silicio de 4 pulgadas con un separador de plasma (PVA TePla 300, PVA AG, Alemania) a 500 W durante 7 minutos para reducir su humectabilidad. Se hizo girar una solución acuosa de dextrano al 20 % (peso/vol) (MP Biomedicals, PM 60 k–90 k g/mol) a 1000 rpm (WS-650-23, Laurell Technologies Corporation, EE. UU.) y se coció a 150 °C durante 2 min para formar una capa de sacrificio soluble en agua de 1 μm de espesor. Esta capa permite que las ventanas se suelten suavemente al final del proceso de fabricación (Figuras complementarias 1a-i). Se recubrió directamente por rotación un fotorresistente negativo (SU-8 3025, Kayaku Advanced Materials, EE. UU.) sobre la capa de sacrificio y se horneó suavemente (Figura complementaria 1a-ii). En particular, con este espesor, el SU-8 tiene una transmitancia superior al 95%60 (https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/07/KAM-SU-8-3000-Datasheet-7.10-final .pdf). Después de la exposición, las ventanas se hornearon posteriormente y la resistencia sin curar se eliminó con un revelador (acetato de éter metílico de propilenglicol (PGMEA, acetato de 1-metoxi-2-propanol), Sigma-Aldrich, Alemania) (Figura complementaria 1a-iii) . A continuación, la oblea con ventanas SU-8 se recubrió con una capa de fotoprotector positivo de 20 μm de espesor (AZ 40XT) utilizando un sistema de procesamiento automatizado (ACS200 Gen3, Süss MicroTec, Alemania). Esta capa adicional de polímero sirve como máscara física durante el proceso de deposición del metal. Se fabricó una segunda máscara cromada para modelar identificadores únicos en las ventanas mediante fotolitografía. A continuación, la oblea se recubrió con películas de Ti y Au61 mediante deposición física de vapor (EVA 760, Alliance-Concept, Francia) con un espesor de 3 nm y 15 nm, respectivamente (Figuras complementarias 1a-iv). El revelado del fotoprotector negativo (Remover 1165, Kayaku Adv. Mat., EE. UU.) eliminó todas las capas en la parte superior de las ventanas excepto los números que sirven como marcadores. Finalmente, las ventanas etiquetadas se liberaron disolviendo la capa de sacrificio en agua DI (Figuras complementarias 1a-vi). Las ventanas se filtraron, se secaron a temperatura ambiente y se esterilizaron antes de su uso en experimentos. Las ventanas resultantes eran ópticamente transparentes (Figura complementaria 1b) y del tamaño apropiado para sellar las aberturas torácicas (Figura complementaria 1c).

Desarrollamos una técnica de microfabricación de dos niveles para maximizar el rendimiento, proteger los moldes maestros del uso excesivo y facilitar la difusión de la tecnología62,63. Brevemente, los implantes se moldearon dentro de plantillas de elastómero que se fabricaron a partir de una oblea grabada que sirvió como molde maestro. Primero, se trató una oblea de prueba de silicio de cuatro pulgadas (100/P/SS/01-100, Siegert Wafer, Alemania) con hexametildisilazano (HMDS) (número CAS: 999-97-3, Sigma-Aldrich, Alemania) y se deshidrató. a 125 °C para mejorar la adhesión a su superficie. Luego, la oblea se recubrió por rotación con una película de 8 μm de espesor de fotorresistente positivo (AZ 9260, Microchemicals GmbH, Alemania) utilizando un sistema de procesamiento de resistencia automático (EVG 150, EV Group, Alemania) (Figura complementaria 3a-i). Después de los pasos de horneado, exposición y desarrollo, la oblea se procesó usando grabado profundo de iones reactivos (DRIE), específicamente un proceso de Bosch,64 (AMS 200 SE, Alcatel) para obtener paredes casi verticales con una alta relación de aspecto (Figura complementaria. 3a-ii). La resistencia positiva restante se eliminó en un removedor (Remover 1165, Kayaku Advanced Materials, EE. UU.) a 70 °C y se limpió enjuagando con agua y secando al aire (Figuras complementarias 3a-iii). Las plantillas de elastómero se fabricaron mediante moldeo réplica utilizando polidimetilsiloxano (PDMS). El proceso de moldeo de réplica comenzó con la deposición de vapor de silano (tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano, Sigma-Aldrich, Alemania) sobre la superficie del molde maestro en una cámara de vacío durante 6 h. La silanización sólo se realizó una vez porque forma una capa de silano permanente. Se preparó PDMS como una mezcla (10:1, peso/peso) del elastómero y el agente de curado (número GMID: 01673921, Dow Europe GmbH, Alemania) y se vertió sobre la oblea en una placa de Petri. Para liberar las burbujas atrapadas dentro de los pocillos de alta relación de aspecto, el molde se desgasificó usando una bomba de vacío (EV-A01-7, Swiss Vacuum Technologies SA, Suiza) en un desecador de vacío (F42020-0000, SP Bel-Art Labware & Apparatus , EE.UU). Finalmente, el elastómero se curó a 65 °C durante 5 h en un horno (UF30, Memmert GmbH, Alemania) y se despegó la losa de PDMS (Figura complementaria 3b). Utilizando marcadores de alineación como guía, la losa se cortó en varios pedazos con una hoja de afeitar para que sirvieran como plantillas con las que luego se podían fabricar implantes (Figura complementaria 3c).

Los implantes flexibles se fabricaron a partir de un polímero fotocurable (Ostemer 220, Mercene Labs AB, Suecia). La polimerización ocurre cuando una mezcla de dos componentes (Parte A y Parte B) se expone a la luz ultravioleta (Figura complementaria 4a-i). La plantilla de PDMS se silanizó (tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano, Sigma-Aldrich, Alemania) durante 1 h en un desecador de vacío (Figuras complementarias 4a-ii). La parte A se calentó a 48 °C durante la noche para asegurarse de que no quedaran cristales sin disolver en la solución. La parte B y el recipiente también se calentaron hasta 48ºC antes de mezclarlos. Luego se mezclaron completamente las partes A y B y la mezcla se desgasificó en una cámara de vacío durante 5 min. Se vertió una gota de 200 μl de la mezcla (1,86:1, peso/peso) sobre la plantilla (Figuras complementarias 4a-iv) y la plantilla se intercaló mecánicamente entre dos portaobjetos de vidrio utilizando dos clips. El portaobjetos de vidrio que toca el polímero del implante se trató previamente con plasma (PDC-32G, Harrick Plasma, EE. UU.) a 29 W durante 1 min para facilitar la liberación del implante mejorando la adhesión entre el vidrio y los implantes. La solución se expuso a luz ultravioleta (365 nm, UV9W-21, Lightning Enterprises, EE. UU.) durante 10 minutos para la polimerización (Figuras complementarias 4a-v). Las muestras se rotaron varias veces durante la exposición a los rayos UV para garantizar una reacción homogénea en toda la plantilla. Los implantes se liberaron agitando mecánicamente las plantillas en alcohol isopropílico (IPA) utilizando un sonicador (DT 100 H, Bandelin Sonorex Digitec, Alemania) (Figuras complementarias 4a-vi). Todo este proceso produjo una oblea con 100 implantes (Fig. 4b, c complementaria) que posteriormente se cortaron con una hoja de afeitar antes de la implantación.

Diseñamos y construimos un brazo manipulador para desplazar temporalmente los órganos torácicos durante la implantación (Figuras complementarias 5a, b). Para construir el brazo, primero imprimimos en 3D un molde que nos permitió pegar un pasador de disección (26002-10, Fine Science Tools, Alemania) a la punta de una aguja de jeringa (15391557, Fisher Scientific, EE. UU.) de manera reproducible ( Figura complementaria 5c). El alfiler se inserta en la aguja hasta que su punta toca el extremo del molde. Pegamos el alfiler a la aguja usando un adhesivo curable con UV (Bondic, Aurora, ON Canadá). Luego, el brazo se dobló con unas pinzas y se guió mediante un segundo molde impreso en 3D (Figura complementaria 5d). El pasador se dobló primero de forma gruesa y luego se ajustó más finamente utilizando el molde impreso en 3D. Luego se utilizó otra pieza impresa en 3D para conectar la aguja de la jeringa a un micromanipulador de 3 ejes (DT12XYZ, ThorLabs, EE. UU.) y a una etapa de extensión (Figura complementaria 5a). Luego, toda la estructura se conectó a una placa (MB1224, ThorLabs, EE. UU.) (Figura complementaria 5b).

Utilizamos escritura láser directa65 para fabricar un mecanismo personalizado que mantiene las moscas en su lugar durante la microscopía de dos fotones. El mecanismo se diseñó utilizando un software CAD 3D (SolidWorks 2021, Dassault Systémes, Francia). Se utilizó una oblea de silicio cortada en cubitos de 25 mm x 25 mm como sustrato sobre el que se imprimieron las estructuras. La superficie del sustrato se trató con plasma a 500 W durante 7 minutos y se recubrió con una solución acuosa de poli(ácido acrílico) al 10 % (peso/vol) (PM 50000, Polysciences, EE. UU.) a 2000 rpm durante 15 s usando un centrifugador. -recubridor (WS-650-23, Laurell Technologies Corporation, EE. UU.) (Figura complementaria 6a-i-iii). El mecanismo se fabricó utilizando un escritor láser directo (Photonic Professional GT+, Nanoscribe GmbH, Alemania) que controla la polimerización de dos fotones (Figuras complementarias 6a-iv). Se eligió un polímero (IP-S, Nanoscribe GmbH, Alemania) como material de impresión debido a su módulo de Young de 4,6 GPa66 y la resolución a la que se podían imprimir las estructuras. El diseño general se dividió en múltiples cuadros porque el área máxima de escaneo láser proporcionada por un objetivo de 25 × (NA 0.8, Zeiss) es de 400 μm. Este enfoque da como resultado una impresión fina en un diseño relativamente grande. El objetivo se sumergió en fotoprotector líquido durante la impresión. Al final del proceso de impresión, el polímero sin curar se eliminó utilizando un revelador (PGMEA, Sigma-Aldrich, Alemania) durante 20 minutos (Figuras complementarias 6a-v). Finalmente, se enjuagó la PGMEA con IPA. El mecanismo se liberó del sustrato disolviendo la capa de sacrificio en agua DI (Figuras complementarias 6a-vi). Esto produjo una estructura microfabricada lo suficientemente grande como para contener el tórax de la mosca (Figura complementaria 6b, c). La etapa de remontaje se completó fijando el mecanismo a un marco de aluminio cortado con láser utilizando pegamento curable por UV (Bondic, Aurora, ON Canadá).

Los materiales y equipos necesarios para fabricar nuestros dispositivos de microingeniería se resumen en las Tablas complementarias 2 y 3.

Aquí se describen los pasos necesarios para preparar moscas para imágenes VNC a largo plazo (Fig. 1e, los órganos internos se han esbozado utilizando datos de la referencia 67). Consulte la Película complementaria 2 para obtener más detalles.

Se anestesió en frío una mosca durante 5 min. Luego se colocó en la parte inferior de una platina de disección y se retiraron sus alas cerca de su base con unas pinzas. Luego se presionó el tórax a través de un orificio (Etchit, Buffalo, MN) en la cuña de acero del escenario (McMaster-Carr, EE. UU.; acero inoxidable de 0,001 pulgadas, recocido blando tipo 316; pieza n.° 2317K11). Luego, se dio la vuelta al escenario y se colocó una pequeña gota de pegamento curable con luz ultravioleta (Bondic, Aurora, ON Canadá) sobre el escutelo para fijar la mosca en su lugar.

El escenario se llenó con solución salina (Tabla complementaria 1). Luego se usó una aguja de jeringa de 30 G para cortar un pequeño orificio rectangular (más pequeño que la ventana de 600 μm de diámetro) en la cutícula torácica dorsal. El agujero se realizó insertando la aguja en la parte posterior del tórax cerca del escutelo. Luego se cortaron tres líneas en el tórax lateral y anterior. Se cortó una línea final para completar una abertura rectangular. Luego se eliminó el trozo de cutícula resultante con unas pinzas.

Los IFM degradados residuales se eliminaron del tórax abierto utilizando unas pinzas. Luego, se utilizó una aguja de vidrio extraída (P-1000, instrumento Sutter, EE. UU.) (30-0018, aparato de Harvard, EE. UU.) para separar pequeños enlaces traqueales entre un trozo grande de tráquea y el lado izquierdo del intestino. Luego también se extrajo la glándula salival izquierda con unas pinzas.

El brazo manipulador se colocó encima del escenario con su punta visible. La plataforma de disección se colocó con la cabeza de la mosca apuntando hacia el experimentador. Luego se insertó la punta del brazo en el tórax utilizando un manipulador de 3 ejes (DT12XYZ, ThorLabs, EE. UU.). Luego se insertó la punta del brazo en el lado derecho del intestino (del experimentador), cerca de la mitad del proventrículo. La punta se insertó lo suficientemente profunda como para estar debajo del buche y las glándulas salivales, pero sin tocar el VNC. Una vez que la punta del brazo estuvo en el lado derecho de la glándula salival, el buche y el intestino, se tiró hacia el lado izquierdo de la cavidad torácica, creando un espacio para el implante cerrado.

Una vez que los órganos de las moscas se sujetaron firmemente en el lado izquierdo de la cavidad torácica mediante el brazo de manipulación, el implante se cerró en el aire usando unas pinzas y luego se transfirió a la solución salina que llenó la etapa de disección. A continuación se colocó el implante cerrado delante de la mosca en el escenario. A continuación se utilizó un par de fórceps más delgados para insertar el implante en el tórax del animal. Finalmente, se utilizó una aguja de vidrio para ajustar la ubicación del implante y mantenerlo a la altura adecuada, permitiendo su apertura pasiva. Una vez abierta, se utilizó la aguja de vidrio para presionar suavemente el lado izquierdo del implante hacia la parte inferior del tórax mientras se retiraba el brazo y para eliminar cualquier burbuja en el implante.

Una vez que el implante estuvo bien colocado, se utilizó una aguja de jeringa (15391557, Fisher Scientific, EE. UU.) para retirar la solución salina del escenario. Luego se colocó una ventana encima del agujero cuticular y se centró con el número de identificación en la parte posterior del tórax cerca del escutelo. Luego se usó un alambre para agregar pequeñas gotas de pegamento curable por luz ultravioleta entre la ventana y la cutícula torácica circundante, comenzando desde el lado derecho del escutelo y terminando en el lado izquierdo. Luego se volvió a agregar solución salina al escenario. El pegamento UV curado, que previamente sujetaba la mosca al escenario, se eliminó con una aguja. Luego también se eliminó la solución salina y la ventana se selló completamente colocando y curando pegamento UV en la cutícula posterior de la mosca cerca del escutelo.

Una vez que el orificio torácico estuvo completamente sellado por una ventana transparente, la mosca se desmontó de la etapa de disección empujando suavemente la parte frontal del tórax a través del orificio en la cuña de acero. Luego, la mosca fue devuelta a un frasco de comida para recuperarse.

Todas las moscas se criaron con alimento estándar de harina de maíz en un ciclo de 12 h de luz: 12 h de oscuridad. Los experimentos para cada estudio en particular se realizaron a una hora constante del día para excluir la posibilidad de factores de confusión relacionados con el ritmo circadiano. No se requirió ninguna aprobación ética específica para los experimentos con Drosophila. Para la mayoría de los experimentos, se utilizaron moscas hembra porque son de mayor tamaño. Esto aumenta la facilidad de disección, implantación y anclaje. También facilita el procesamiento computacional de imágenes y la detección de regiones neuronales de interés.

Se implantaron moscas hembra que expresaban CsChrimson en neuronas descendentes Moonwalker (MDN)28 (UAS-CsChrimson/Act88F-Rpr; VT50660.p65AD(attp40)/+; VT44845.Gal4DBD(attp2)/+) (Fig. 2) a los cinco días. post-eclosión (dpe). Para este experimento, antes de la implantación, los implantes se sumergieron en una solución de dextrano de 30 mg/ml (#31392, Sigma-Aldrich, Suiza) mientras estaban cerrados mecánicamente. Luego se sacaron los implantes de la solución y se secaron usando un Kimwipe retorcido (5511, Kimberly-Clark, EE. UU.). Este paso se realizó para fijar los implantes en una posición cerrada. Sin embargo, más tarde descubrimos que no se requiere dextrano para cerrar los implantes y eliminamos este paso. Luego se colocaron los implantes en el tórax de la mosca como se describe anteriormente. El número de días posteriores a la implantación se denomina "días posteriores a la implantación" (dpi). Se seleccionaron animales de control de la misma edad y sexo del mismo cruce parental. Para los estudios de longevidad, las moscas se alojaron individualmente en viales de comida y se evaluaron cada 1 o 2 días.

Los estudios de locomoción se realizaron a 1 a 3 ppp, 14 a 16 ppp y 28 a 30 ppp. Los animales fueron anestesiados individualmente en frío y luego transferidos a arenas cuadradas redondeadas para activación optogenética y grabación de video. Cada grabación consistió en 30 s de comportamientos generados espontáneamente (principalmente caminar y arreglarse), seguidos de tres períodos de 3 s de estimulación optogenética a 590 nm (6 mW/cm2) con intervalos entre estímulos de 10 s. Por tanto, cada sesión de grabación tuvo una duración de 59 s.

Para procesar datos de video, se rastrearon los centroides de las moscas utilizando una versión personalizada de Tracktor68. Luego, sus orientaciones se extrajeron utilizando una red neuronal (implementada en PyTorch69) que se entrenó con datos etiquetados manualmente. La red constaba de dos capas convolucionales seguidas de tres capas completamente conectadas. Todas las capas, excepto la final, fueron seguidas por una función de activación ReLU70. También aplicamos el abandono después de las dos primeras capas completamente conectadas con una probabilidad de 0,271. Para entrenar la red, anotamos manualmente un total de 300 muestras en tres orientaciones (cabeza arriba, cabeza abajo y de lado). Luego, las imágenes en escala de grises se recortaron utilizando las ubicaciones de los centroides de Tracktor y se redimensionaron a 32 × 32 píxeles. Durante el entrenamiento, aplicamos aleatoriamente transformaciones afines (20 grados de rotación, 5 píxeles de traslación y factor de escala de 0,2), aumentos de giro horizontal y vertical con una probabilidad de 0,5. Utilizamos el paquete torchvision de PyTorch para todo el aumento de datos. La red se entrenó con pérdida de entropía cruzada utilizando el 80% de los datos. Utilizamos un optimizador Adam con una tasa de aprendizaje de 0,001, sin caída de peso ni caída de la tasa de aprendizaje72. Entrenamos durante 1000 épocas y seleccionamos los pesos con el mejor error de prueba.

Las velocidades de traslación se calcularon aplicando un filtro Savitzky-Golay de segundo orden con una derivada de primer orden a las posiciones del centroide. El signo de los valores de velocidad se ajustó a negativo para los movimientos contrarios a la dirección de avance del animal. Las moscas que chocaron con las paredes de la arena durante más de 0,3 s durante el período de estimulación fueron excluidas del análisis. También se excluyeron del análisis las moscas que fueron volteadas dorsalmente (es decir, caminando sobre el techo recubierto de sigma) durante el período de estimulación. La métrica de la 'pendiente de respuesta al caminar hacia atrás' se calculó como la aceleración desde el comienzo de cada período de estimulación hasta la velocidad mínima (velocidad máxima hacia atrás) alcanzada en ese período. La métrica de la "distancia recorrida hacia atrás" se calculó como la suma de Riemann izquierda de las curvas de velocidad durante cada período de estimulación. Solo consideramos cuadros donde la velocidad era negativa. Finalmente, la 'velocidad de traslación negativa máxima' es el valor de velocidad mínimo alcanzado en cada período de estimulación.

Para los estudios de supervivencia y comportamiento de los machos, se implantaron animales que expresaban Reaper en sus músculos de vuelo indirecto (Act88F-Rpr; UAS-GFP; +/+) 1 día después de la eclosión (dpe). Se seleccionaron animales de control ('intactos') de la misma edad y sexo del mismo cruce parental. Las moscas se alojaron individualmente en viales de comida y se voltearon todos los días en un vial de comida nuevo mientras se evaluaba su longevidad (Figura complementaria 10). Se registró el comportamiento espontáneo de tres machos por grupo. Estos machos fueron anestesiados individualmente con frío y luego transferidos a arenas cuadradas redondeadas para grabaciones de video. Cada grabación consta de 60 s de comportamientos generados espontáneamente.

Se implantaron moscas hembra que expresaban GFP en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GFP; +/+) (Fig. 1h) a 4-6 dpe y se mantuvieron individualmente en viales de alimentos. A 1–3 ppp, 14–16 ppp y 28–30 ppp, las moscas se ataron a una plataforma de remontaje y se adquirieron 25 volúmenes de imágenes de 100 μm de profundidad (tamaño de paso de 1 μm) utilizando un microscopio de dos fotones (microscopio Bergamo II, ThorLabs, EE. UU.) y un láser de 930 nm (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, EE. UU.) con 20 mW de potencia en el lugar de la muestra. Adquirimos 0,1 volúmenes por segundo (vps) utilizando un escáner de Galvo-Resonancia23. Luego, las 25 imágenes por profundidad se registraron entre sí utilizando el módulo HyperStackReg en Fiji73 y una transformación de cuerpo rígido. A continuación, estas imágenes registradas se proyectaron a lo largo del eje del tiempo en una imagen de desviación estándar. Luego, el volumen resultante se codificó con colores de profundidad utilizando la macro Color temporal de Fiji.

Para experimentos en moscas macho, tomamos imágenes de animales que expresan GFP en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr; GMR57C10-Gal4/UAS-GFP; +/+) (Figura complementaria 10). Estos animales fueron implantados a 1 dpe y mantenidos individualmente en viales de alimento. A 1 ppp, 5 ppp y 10 ppp, se ataron las moscas y se realizó un registro volumétrico del VNC utilizando un microscopio de dos fotones a 930 nm con 11 mW de potencia láser. Las moscas se anestesiaron utilizando dióxido de carbono (1,3 l/min) aplicado ventralmente mientras se registraban los volúmenes de imágenes. Los volúmenes consistían en fotogramas de 512 × 512 píxeles tomados cada 1 μm en una profundidad total de 100 μm. Luego se generaron proyecciones Z con codificación de colores de profundidad utilizando la macro 'Color temporal' de Fiji.

Se implantaron moscas que expresaban GCaMP6f y tdTomato en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) a 5 dpe (hembra) o 1 dpe (macho) y luego se montaron en el etapa de imágenes de dos fotones a 1, 5 y 10 ppp (mujer, película complementaria 4; hombre, película complementaria 5). Se adquirió un plano de imagen horizontal del neurómero protorácico utilizando un microscopio de dos fotones a 930 nm con 25 mW de potencia. Se adquirieron tres imágenes horizontales en el plano z utilizando un escáner de Galvo-Resonancia y se promediaron en un cuadro a una velocidad de imagen de 10,7 fps. Los fotogramas de comportamiento se adquirieron simultáneamente (como en la referencia 23) a una velocidad de 80 fps.

Se implantó una mosca hembra que expresa GCaMP6f y tdTomato en neuronas descendentes ADN0123,48 (Act88F-Rpr/+; GMR22C05-AD-spGal4/UAS-GCaMP6f; GMR56G08-DBD-spGal4/UAS-tdTomato) a 3 dpe. Luego se montó la misma mosca en la platina del microscopio de dos fotones a 1, 3 y 5 ppp. Se adquirió un plano de imagen horizontal del neurómero protorácico utilizando un microscopio de dos fotones a 930 nm con 28 mW de potencia láser. Las imágenes del plano horizontal se adquirieron utilizando un escáner Galvo-Galvo a una velocidad de imagen de 5,6 fps. Los fotogramas de comportamiento se adquirieron simultáneamente (como en la referencia 23) a una velocidad de 80 fps. Se utilizó AxoID para detectar neuronas como regiones de interés (ROI) en imágenes de microscopio de dos fotones y extraer sus valores de fluorescencia50. El clasificador de eventos de fluorescencia neuronal semiautomático descrito en la ref. 50 se utilizó para detectar eventos de actividad neuronal a partir de rastros de fluorescencia. Luego se correlacionaron con las rotaciones esféricas en la cinta rodante.

Para ilustrar cómo se podrían utilizar otros diseños de implantes para obtener acceso óptico a las regiones posteriores del VNC (Fig. 9 complementaria), una mosca hembra que expresa GFP en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) se diseccionó a 3 dpe. Se curó una gota de pegamento UV en la punta de un implante. La implantación también se modificó ligeramente: una vez insertado en el tórax de la mosca, el implante se empujó hacia atrás con el pegamento curado apoyado contra la cutícula interior del escutelo, fijando el implante en su posición. Luego se cerró la mosca mediante una ventana transparente. Se registró un volumen de imágenes (576 × 576 píxeles y 100 μm de profundidad) del VNC utilizando un microscopio de dos fotones con un escáner Galvo-Galvo a 930 nm con 22 mW de potencia láser.

Se implantaron moscas hembra que expresaban GFP en sus órganos cordotonales (Act88F-Rpr/+; iav-Gal4/UAS-GFP; +/+) (Fig. 3) a 1 dpe. Se registró una pila z del VNC a 1 ppp, utilizando un microscopio de dos fotones a 930 nm con 55 mW de potencia láser. Las moscas fueron anestesiadas con dióxido de carbono (1,8 l/min) suministrado ventralmente mientras registraban pilas en z. Las pilas Z consistieron en cuadros de 576 × 384 píxeles tomados cada 1 μm en una profundidad total de 100 μm (es decir, 100 cuadros por volumen). Luego se extrajo la pata delantera izquierda en la articulación tórax-coxa utilizando tijeras de disección (#15300-00, Fine Science Tools, Alemania). Inmediatamente se registró una segunda pila z. Las moscas se mantuvieron individualmente en viales de comida y se tomaron imágenes todos los días usando los mismos parámetros de grabación hasta 15 ppp. Luego se utilizó la alineación lineal de la pila de Fiji con el complemento de registro SIFT74 para registrar todas las pilas z proyectadas en la primera pila z. Luego se utilizó una secuencia de comandos Python personalizada para dibujar y extraer la fluorescencia media de regiones de interés específicas. La fluorescencia media dentro de estas regiones se midió para cada día y se normalizó entre los animales dividiéndolas por la fluorescencia media del primer día.

Los sistemas nerviosos de las moscas se diseccionaron y fijaron con paraformaldehído (441244, Sigma-Aldrich, EE. UU.) a 20 ppp. Las muestras se tiñeron contra nc82 con anticuerpo primario anti-nc82 de ratón diluido a 1:20 en solución PBST y luego siguieron con anticuerpo secundario conjugado Alexa 633 anti-ratón de cabra diluido a 1:500 (procedimiento detallado descrito en la referencia 23). Esto nos permitió adquirir imágenes confocales que incluían tanto puntos de referencia de neuropilos como expresión endógena de GFP. Se utilizó el software Zen 2011 14.0 para adquirir imágenes confocales. Las intensidades del láser confocal y las ganancias de PMT se seleccionaron manualmente para evitar la saturación de píxeles. Luego, estas pilas z confocales se proyectaron en 2D utilizando la proyección de desviación estándar de Fiji. La proyección de desviación estándar de la expresión de GFP se muestra como una imagen invertida (Fig. 3c, d). Se escribió un script de Python personalizado para detectar los límites de VNC utilizando la proyección de desviación estándar de imágenes nc82. Este contorno se detectó utilizando la biblioteca Open CV y luego se dibujó en imágenes de proyección de desviación estándar de GFP.

Moscas hembra (5 dpe) que expresan un indicador de calcio, GCaMP6f, y un marcador anatómico, tdTomato, en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) (Fig. 4) Pasaron hambre durante 21 a 23 h con un Kimwipe húmedo (5511, Kimberly-Clark, EE. UU.). Luego se implantaron sin ventana torácica y se mantuvieron en la etapa de disección (aquí no se utilizó la etapa de remontaje) para limitar el número de intervenciones. Luego se colocaron los animales bajo un microscopio de dos fotones donde podían caminar sobre una cinta rodante esférica que consistía en una bola de espuma soportada por aire (0,8 L/min) (Last-A-Foam FR7106, General Plastics, EE. UU.) con un diámetro de 1 cm23. Luego se tomaron imágenes de las secciones transversales coronales de su conectivo cervical a 930 nm con una potencia de láser de 15 mW. Logramos una velocidad de imágenes de 16 fotogramas por segundo (fps) mediante el uso de un escáner de Galvo-Resonancia. Paralelamente, se registró el comportamiento de las moscas mediante siete cámaras a 80 fps. También se midieron las rotaciones de las bolas a lo largo de tres ejes utilizando dos sensores de flujo óptico6,23. Registramos la actividad neuronal y el comportamiento en pruebas de aproximadamente 4 minutos cada una. Primero, se registraron cuatro ensayos. Luego, se bajó la bola de espuma y se continuó el registro mientras las moscas se alimentaban de una solución que consistía en (i) 1 ml de agua desionizada, 8 mg de sacarosa (A2188.1000, Axon Lab, Suiza) y 1 mg de colorante de amaranto (A1016, Sigma-Aldrich, EE. UU.), (ii) una solución de cafeína de baja concentración que consiste en 1 ml de agua desionizada, 8 mg de cafeína (C0750, Sigma-Aldrich, EE. UU.), 8 mg de sacarosa y 1 mg de Amaranto, o (iii) una solución alta Solución de cafeína sobresaturada de concentración compuesta por 1 ml de agua desionizada, 40 mg de cafeína, 8 mg de sacarosa y 1 mg de Amaranto. Los animales se alimentaron utilizando una aguja de vidrio extraída (P-1000, instrumento Sutter, EE. UU.; parámetros del extractor: calor: 502; extracción: 30; velocidad: 120; tiempo: 200; presión: 200). Se añadió una pequeña gota de pegamento curable por luz ultravioleta (Bondic, Aurora, ON Canadá) cerca de la punta de la aguja para evitar que la solución suba por la aguja. La aguja se colocó delante de las moscas utilizando un manipulador (uMp-3, Sensapex, Finlandia). Después de la alimentación, la cinta de correr esférica se reposicionó debajo de la mosca y se adquirieron ocho pruebas de imágenes más.

Usamos código Python personalizado a menos que se indique lo contrario. Para todos los análisis de imágenes, el eje y es ventral-dorsal a lo largo del cuerpo de la mosca y el eje x es medial-lateral. Los tamaños de núcleo de imagen y filtro se especifican como (y, x) en unidades de píxeles. Las grabaciones del conectivo cervical torácico sufren de grandes movimientos entre marcos que incluyen grandes traslaciones, así como deformaciones más pequeñas y no afines. Debido a que los indicadores de calcio (p. ej., GCaMP6f) están diseñados para tener una fluorescencia inicial baja, su uso para la corrección del movimiento resulta complicado. Por lo tanto, confiamos en las señales de la proteína fluorescente roja coexpresada, tdTomato, para registrar las imágenes del canal PMT rojo (tdTomato) y verde (GCaMP6f). Primero, realizamos el registro del centro de masa (COM) de cada cuadro grabado para eliminar traducciones grandes y recortamos las regiones de fondo alrededor del conectivo del cuello (de 480 × 736 a 352 × 576). Luego, calculamos el campo de movimiento de cada cuadro rojo en relación con el primer cuadro grabado usando flujo óptico y corregimos el movimiento de los cuadros rojo y verde usando interpolación bilineal. El algoritmo para la corrección del movimiento del flujo óptico se describió previamente en la ref. 23. Solo utilizamos el componente de flujo óptico para calcular los campos de movimiento y omitimos la restricción de coincidencia de características. Regularizamos el gradiente del campo de movimiento para promover la suavidad (λ = 800). El código Python para el paquete de corrección de movimiento de flujo óptico (ofco) se puede encontrar en https://github.com/NeLy-EPFL/ofco.

Observamos que los valores absolutos de fluorescencia eran ligeramente más bajos en el lado derecho del conectivo que en el lado izquierdo, probablemente debido a la dispersión de los órganos torácicos que el implante empuja hacia la derecha. Para corregir esta fluorescencia absoluta desigual, calculamos la media de todos los fotogramas corregidos por movimiento a lo largo del tiempo. Luego filtramos la imagen resultante con un filtro de mediana y de paso bajo (filtro de mediana: (71,91), filtro gaussiano: σ = 3) para eliminar las características de las neuronas individuales y retener solo los cambios espaciales globales en la fluorescencia. Luego calculamos la media en el eje y para obtener un perfil de fluorescencia en el eje x (izquierda - derecha) y ajustamos una línea recta a los 200 píxeles más centrales. Para corregir la disminución de la fluorescencia hacia el lado derecho, multiplicamos la fluorescencia con el valor inverso de esta línea recta ajustada al perfil del eje x. Tenga en cuenta que esta corrección solo ayuda en la visualización de la fluorescencia y no tiene ningún impacto en el cálculo de ΔF/F porque, para un píxel determinado, tanto la fluorescencia en cada punto temporal como su fluorescencia inicial se multiplican por la misma constante. factor.

Para eliminar el ruido de los datos registrados y corregidos, utilizamos una versión adaptada del algoritmo DeepInterpolation75. Brevemente, DeepInterpolation utiliza una red neuronal para eliminar el ruido de una imagen de microscopía "interpolándola" desde fotogramas temporalmente adyacentes. Una U-Net se entrena de manera no supervisada utilizando 30 fotogramas (alrededor de 2 s) antes y 30 fotogramas después del fotograma objetivo como entrada y el fotograma actual como salida. De este modo, se elimina el ruido independiente de la imagen y se retienen los componentes que evolucionan dinámicamente a lo largo del tiempo. Modificamos el procedimiento de entrenamiento para colocar un lote en los 11 GB de RAM de una tarjeta gráfica Nvidia GTX 2080TI: en lugar de usar el cuadro completo (352 × 576 píxeles), usamos un subconjunto de la imagen (352 × 288 píxeles) durante el entrenamiento. Seleccionamos aleatoriamente la coordenada x del subconjunto. Durante la inferencia, utilizamos la imagen completa. Verificamos que el uso de diferentes tamaños de imágenes durante el entrenamiento y la inferencia no cambió la imagen sin ruido resultante fuera de las regiones fronterizas. Entrenamos un modelo para cada mosca utilizando 2000 cuadros seleccionados al azar de una de las pruebas antes de alimentarlos y lo aplicamos a todos los cuadros posteriores. Los parámetros de entrenamiento se describen en la Tabla 1. El algoritmo de DeepInterpolation adaptado se puede encontrar en la rama "adapttoR57C10" del siguiente repositorio de GitHub: https://github.com/NeLy-EPFL/deepinterpolation

Mostramos los valores de fluorescencia como ΔF/F (Películas complementarias 10-12). Esto se calculó como \({{\Delta }}F/F=\frac{F-{F}_{0}}{{F}_{0}}\), donde F es la fluorescencia variable en el tiempo y F0 es la línea base de fluorescencia por píxeles. Para calcular F0, aplicamos un filtro gaussiano espacial (σ = 10) a las imágenes y convolucionamos cada píxel con una ventana temporal de 10 muestras (alrededor de 0,6 s). Luego identificamos la fluorescencia mínima de cada píxel en todas las pruebas.

Se han utilizado sensores de flujo óptico para medir las rotaciones esféricas de las cintas de correr6,23, pero son intrínsecamente ruidosos. Por lo tanto, calculamos el promedio móvil en 80 muestras (alrededor de 200 ms). A partir de los valores de los sensores preprocesados, calculamos las velocidades de avance, lateral y de giro6. Clasificamos los períodos estacionarios (sin movimientos de la pelota) como períodos en los que los valores absolutos del flujo óptico de las velocidades de rotación esféricas de la cinta rodante estaban por debajo de un umbral de \(0,31 {{{{{{{{\rm{ms}}}}}} }}}^{-1}\widehat{=}0,01\) rotaciones/s y al menos el 75 % de los fotogramas dentro del tiempo ± 0,5 s de la muestra estaban por debajo de este umbral. Este último criterio aseguró que se excluyeran los períodos cortos de inmovilidad entre las sesiones de caminata.

Registramos tres modalidades de datos diferentes en tres frecuencias de muestreo diferentes: los datos de imágenes de dos fotones se registraron a ~16 Hz, las imágenes de comportamiento de siete cámaras se adquirieron a 80 Hz y los movimientos de la bola utilizando dos sensores de flujo óptico se midieron a casi 400 Hz. Por lo tanto, para sincronizar estas mediciones para un análisis posterior, redujimos todas las mediciones a la velocidad de fotogramas de imágenes de dos fotones promediando todas las muestras de comportamiento y rotación de la bola adquiridas durante un fotograma de dos fotones.

Para calcular los rastros de fluorescencia normalizados para cada prueba, como se muestra en la Fig. 4e, promediamos la fluorescencia en todo el conectivo cervical y calculamos el percentil del 99% de esta serie de tiempo durante las pruebas antes de la alimentación. Luego normalizamos la serie temporal de todas las pruebas registradas de esa mosca al percentil previo a la alimentación del 99%. Para realizar el análisis estadístico, utilizamos fluorescencia normalizada y calculamos el máximo (límite superior del percentil 99%) dentro de ciertos períodos de tiempo antes, durante y después de la alimentación. Antes de la alimentación, la fluorescencia normalizada máxima es la unidad para cada una de las 9 moscas, como se esperaba de la normalización percentil. Para períodos durante, <9 min después, <19 min después, <29 min después y <38 min después de la alimentación, realizamos pruebas U de Mann-Whitney para determinar si la actividad neuronal máxima después de la ingestión elevada de cafeína era significativamente diferente de la máxima. actividad después de la sacarosa o la ingesta baja de cafeína (Fig. 4g). Con el objetivo de aplicar la menor cantidad o preprocesamiento necesario, hasta este punto, utilizamos datos de fluorescencia que no fueron eliminados mediante DeepInterpolation. Sin embargo, en este caso, para analizar la sincronización precisa de las ondas, aplicamos DeepInterpolation como se describe anteriormente. Esto reduce la fluorescencia de fondo y el ruido de alta frecuencia. Para analizar la progresión temporal de las ondas de fluorescencia, primero identificamos el momento del pico de fluorescencia en todo el Tpico conectivo cervical. Todos los tiempos se dan en relación con el tiempo de ese pico, lo que permite un análisis de diferencias de tiempo precisas. Luego calculamos la fluorescencia media a lo largo del tiempo dentro de regiones de interés seleccionadas manualmente (conectivo dorsal, lateral y ventral, así como neuronas de fibra gigante) y las representamos normalizadas a sus valores mínimo y máximo. Suavizamos la serie temporal con un filtro gaussiano (\(\sigma=3\widehat{=}0.18\) s). Para identificar el tiempo pico para cada píxel, aplicamos un filtro gaussiano temporal (\(\sigma=10\widehat{=}0.62\) s) y un filtro gaussiano espacial (σ = 1) y buscamos el valor máximo de fluorescencia dentro de Tpeak ± 10 s. En la Fig. 4f mostramos la fluorescencia media durante los períodos en los que la mosca estaba estacionaria (es decir, sin mover la pelota).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos sin procesar generados en este estudio se depositaron en un repositorio público disponible en: https://dataverse.harvard.edu/dataverse/long_term_imaging_vnc_drosophila. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Los códigos personalizados utilizados para analizar los datos sin procesar están disponibles en: https://github.com/NeLy-EPFL/Long-Term-Imaging-VNC-Drosophilahttps://doi.org/10.5281/zenodo.6826488.

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Agradecemos a Alain Herzog por las fotos y vídeos de animales implantados. LH agradece el apoyo de una subvención Marie Skłodowska-Curie de H2020 de la UE (754354). JB agradece el apoyo de un estipendio de doctorado del Boehringer Ingelheim Fonds. VLR agradece el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México, CONACYT, bajo la subvención número 709993. SG agradece el apoyo de una beca EPFL SV iPhD. La FA reconoce el apoyo de un estipendio de doctorado del Boehringer Ingelheim Fonds. MSS reconoce el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.° 714609). PR reconoce el apoyo de una subvención del Proyecto SNSF (175667) y una subvención SNSF Eccellenza (181239).

Estos autores contribuyeron igualmente: Laura Hermans, Murat Kaynak.

Laboratorio de Neuroingeniería, Brain Mind Institute e Instituto de Bioingeniería, EPFL, Lausana, Suiza

Laura Hermans, Jonas Braun, Victor Lobato Rios, Chin-Lin Chen, Adam Friedberg, Semih Günel, Florian Aymanns y Pavan Ramdya

Laboratorio de Sistemas Microbiorobóticos, Instituto de Ingeniería Mecánica e Instituto de Bioingeniería, EPFL, Lausana, Suiza

Laura Hermans, Murat Kaynak y Mahmut Selman Sakar

Laboratorio de Visión por Computadora, EPFL, Lausana, Suiza

Semih Gunel

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Correspondencia a Mahmut Selman Sakar o Pavan Ramdya.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Davide Raccuglia y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

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Hermans, L., Kaynak, M., Braun, J. et al. Los dispositivos de microingeniería permiten obtener imágenes a largo plazo del cordón nervioso ventral en el comportamiento de Drosophila adulta. Nat Comuna 13, 5006 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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Recibido: 13 de noviembre de 2021

Aceptado: 04 de agosto de 2022

Publicado: 25 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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